[发明专利]一种RNA的一步裂解一管法RT-PCR检测方法

摘要

本发明提供了一种RNA的一步裂解一管RT-PCR（one-Step-lysis and One-tube RT-PCR，SORT-PCR）检测方法。本发明方法与采用传统的RT-PCR方法相比，不需要纯化抽提RNA，在细胞裂解后把RNA杂交结合到固定的特异引物或Oligo(dT)引物上，洗涤去除细胞裂解液上清的其他成分，然后加入逆转录（RT）反应体系进行RT反应，再次吸干后，加入PCR反应体系，进行PCR反应，结果检测可采用荧光实时定量分析。本发明将原本长达3个小时以上的RNA检测过程缩短为约2个小时，操作简便易行，具有较高的检测的灵敏度和特异性，适合对各种来源的样品裂解得到RNA进行检测。

主权项

一种RNA的一步裂解一管法RT‑PCR检测方法，所述方法包括：（1）设计与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25～40mer的单链寡核苷酸DNA，记为引物A；该引物的GC含量为40～60%，解链温度为70～85℃；或者，若目标RNA为带poly(A)末端的mRNA，则引物A选用长度为29～50mer的Oligo(dT)；将引物A固定在PCR管内，得到固定PCR管；（2）取待测样本，加入添加有表面活性剂和RNA酶抑制剂的裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；（3）取裂解上清液20uL至固定PCR管中，50～60℃保温10～30min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤1次，吸干，加入20uL由RT酶、dNTP和RT缓冲液配制的RT反应液，42℃保温0.5～1小时；（4）吸干管内液体，加入20uL由耐热DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液和PCR引物配制的PCR反应液，进行PCR扩增，扩增产物进行荧光定量分析或琼脂糖凝胶电泳分析；（5）以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤（1）～（4）的方法进行处理和分析，以样本Ct值小于空白裂解液Ct值判断为阳性。