[发明专利]一种快速高效的丛枝菌根真菌染色的方法

摘要

本发明涉及一种快速高效的丛枝菌根真菌染色的方法，属于应用微生物学领域。本发明设计一种用于快速高效对植物根部丛枝菌根真菌进行染色观察的方法。首先通过20% KOH溶液在高温下对根部组织进行透明化处理，并使用H2O2对根部组织进行漂白，然后使用0.1％台盼蓝进行染色，脱色液脱色后即可进行对丛枝菌根真菌结构进行观察。本染色方法具有方便、快速、高效的特点，脱色彻底，染色效果清晰，丛枝结构和泡囊结构明晰可辨，着色持久的特点。通过本发明能够对大部分植物的根部进行染色，可以清楚的对丛枝菌根真菌的丛枝和泡囊结构进行观察，在菌根研究逐渐受到重视的情况下，具有良好的应用前景。

主权项

一种快速高效的丛枝菌根真菌染色并确定AMF侵染率的方法，按照下述步骤进行：A、固定：将采集的植物根样在尼龙网中清洗干净，每5g根样倒入FAA固定液 50 ml，并用玻璃棒轻压根样，使其完全浸泡在FAA固定液中，固定4 h以上；如果采集植物根样后可以立即进行下一步处理，则省略该步骤；B、消化：将采集的植物根样或FAA固定液中的根样冲洗干净后，按每5g根样加入10％W/V KOH溶液50 ml，在121 ℃高压灭菌5~10 min，以除去根样中的细胞质，经过消化后根样呈透明状，以便于染色观察；C、漂洗：在室温冷却后，将根样从KOH溶液中取出，用蒸馏水冲洗干净，若KOH处理后根样的颜色为褐色或深黄色，则将根样置于250 ml三角烧瓶中，按每5g根样加入H2O2漂洗液100 ml，H2O2漂洗液为分析纯，有效含量不少于3% W/V，漂白根样5~10 min；若步骤B消化处理后的根样为无色或半透明状，则省略漂洗步骤，直接进行下一步的酸化处理；D、酸化：然后将根样置于150 ml三角烧瓶中，按每5g根样加入1％W/V HCl 50 ml，酸化3～5 min；E、染色：将根样取出冲洗干净后置于150 ml三角烧瓶中，按每5g根样加入0.1％W/V 台盼蓝染色液50 ml，煮沸10min；F、脱色：待冷却后，将根样取出，用蒸馏水冲洗掉染色液，然后将根样置于250 ml三角烧瓶中，按每5g根样加入50％W/V 乳酸溶液100 ml，脱色10 min以上；G、观察：将染色后的根样段切成1 cm，于光学显微镜下观察，凡出现菌丝、孢子或者丛枝AMF结构，就将其计成已被侵染根段，计算AMF侵染率；其中所述的FAA固定液配制方法为甲醛、冰醋酸、50％W/V乙醇按体积比为10:5:85，混匀，试剂瓶盛放，常温保存；其中所述的0.1％W/V台盼蓝染色液为按每0.3 g Trypan blue 溶于300ml脱色液中，混合均匀；其中所述的根样为酢浆草根样、狗尾草根样、大叶黄杨根样或加拿大一枝黄花根样。