[发明专利]水稻白叶枯病菌中的酸性还原酮加双氧酶的鉴定方法

摘要

本发明公开了一种水稻白叶枯病菌中的酸性还原酮加双氧酶的鉴定方法，按照以下步骤具体实施：步骤1、制备细菌菌株、质粒，设置培养条件；步骤2、进行xard基因的克隆和测序；步骤3、进行xard基因突变和互补实验；步骤4、进行硫源利用的测试；步骤5、进行剪叶接种实验，得到叶片病斑平均值。本发明的有益效果是，给出了一种水稻白叶枯病菌中的酸性还原酮加双氧酶E2的鉴定方法，以及该酶在甲硫氨酸急救途径中的作用。

主权项

一种水稻白叶枯病菌中的酸性还原酮加双氧酶的鉴定方法，其特点是，按照以下步骤具体实施：步骤1、制备细菌菌株、质粒，设置培养条件制备水稻白叶枯Xoo菌株PXO99A，大肠杆菌Escherichia coli DH5α、S17‑1和S17‑1λpir；构建pKCxard和pUxard两个质粒，其中的pKCxard是载体pKNOCK‑Cm带有xard基因中254bp片段；其中的pUxard是指载体pUFR034带有整个642bp的xard基因，两个质粒的培养条件与文献中描述相同；步骤2、进行xard基因的克隆和测序根据Xoo菌株KACC10331基因组序列，设计特异性引物Pxard‑1和Pxard‑2；以Xoo菌株PXO99A基因组DNA为摸板，PCR扩增得到产物，纯化后连接到载体pMD18‑T并测序；步骤3、进行xard基因突变和互补实验xard基因中254bp片段通过引物PMxard‑1和PMxard‑2扩增得到，克隆到载体pKNOCK‑Cm中得到pKCxard；通过标准的操作方法得到S17‑1λpir/pKCxard；同样的方法得到xard基因的突变体；利用引物Pxard‑1和Pxard‑2检测xard基因和“双拷贝”片段，利用另一对引物Pcat‑1和Pcat‑2来检测氯霉素抗性基因；将野生型菌株中xard基因克隆到载体pUFR034中得到pUxard，再将pUxard转化到S17‑1中，利用两亲交配方法转入xard突变体中，进行功能互补实验；步骤4、进行硫源利用的测试；步骤5、进行剪叶接种实验将菌株PXO99A、Mxard3和Mxard3/pUxard培养到终浓度为108CFU/ml，对温室中21天IR24水稻品种的叶片剪叶接种该三个菌株；15天后量取病斑，得到叶片病斑平均值。