[发明专利]一种肿瘤外切酶体疫苗的提取方法及其应用

摘要

本发明提供一种肿瘤外切酶体（exosome）疫苗的提取方法，通过从人胆管癌细胞的培养液上清中成功提取了exosome，并且通过超滤裂解的方法提取了不含miRNA的exosome裂解超滤液。本发明获得的不含miRNA的exosome裂解超滤液能够更加明显的刺激免疫细胞产生特异性的肿瘤杀伤作用，能大幅提高免疫细胞对肿瘤产生的特异性免疫应答的杀伤效果以及降低肿瘤细胞的免疫逃逸水平，增强人体免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

主权项

一种肿瘤外切酶体疫苗的提取方法，其特征在于，通过以下步骤实现： （1）提取：胎牛血清在4℃条件下，离心6h，除去内源性exosome，人胆管癌细胞在含10％的胎牛血清的1640培养液中，培养约72h，收集培养基上清，按药品生产质量管理规范标准提取肿瘤外切酶体，上清液离心5分钟，转移至新的离心管离心30分钟，再转移至新的离心管离心30分钟，去除细胞碎片；上清液再用millipore公司超滤管离心30分钟；将浓缩液移至30 g／L的蔗糖重水垫上，超速离心60分钟，取出蔗糖重水垫，稀释到50ml的PBS中，再用超滤管离心，直至体积<5 ml，以0.22um的滤器过滤除菌，分装后置于‑80℃冰箱备用；（2）提取裂解超滤液：取超速离心后的exosome沉淀，加入去离子水10ml，低渗法使exosome破膜，用millipore公司超滤管离心30分钟去除miRNA提纯exosome裂解超滤液。