[发明专利]一种蛋白质定量方法

摘要

本发明涉及一种使用pH选择性二甲基化标记和一级二级谱结合定量的蛋白质定量方法。包括选择性二甲基化标记、使用mascot distiller软件对一级谱肽段定量、使用“force‑find”程序对二级谱肽段定量。蛋白质样品首先使用胰蛋白酶进行酶解；酶解产物先于酸性条件下在反相捕集柱上进行选择性的N‑端氨基二甲基化标记；然后在碱性条件下在反相捕集柱上对肽段侧链氨基进行二甲基化标记；以精氨酸结尾的肽段使用mascot distiller进行定量；以赖氨酸结尾的肽段使用“force‑find”程序进行定量。本发明的优点是与传统的基于b,y离子的两端标记二级谱定量方法相比，其操作较为简单，标记效率高，标记选择性好，定量精密度、准确度、覆盖度高。

主权项

一种蛋白质定量方法，其是使用pH选择性二甲基化标记和一级质谱二级质谱结合定量的蛋白质定量方法，包括：蛋白质的胰蛋白酶酶解产物先在反相柱上于酸性条件下二甲基化标记肽段末端氨基，然后在反相柱上于碱性条件下二甲基化标记肽段侧链氨基；将标记完成的肽段使用B相为80％ACN+0.1％‑5％FA+20％H2O洗脱下来进行质谱分析，对质谱分析得到的结果文件进行数据库搜索，使用mascot distiller软件对一级质谱肽段定量、使用“force‑find”程序对二级质谱肽段定量；结合一级质谱信息和二级质谱信息对蛋白进行定量分析；具体过程如下：将两份蛋白质样品分别采用胰蛋白酶酶切；酶解产物分别上样到两个C18反相捕集柱上，在pH 2.8～3.2下通入体积浓度4％的CH2O和0.6M的NaBH3CH的混合溶液，使肽段末端的氨基被二甲基化，标记完通入A相除去过量标记试剂，A相为2％ACN+0.1％FA+98％H2O；然后在pH 7.5～8.0分别通入4％的CD2O和0.6M的NaBH3CH，体积比v/v＝1:1的混合溶液对肽段侧链氨基进行二甲基化标记；标记完通入A相除去过量标记试剂；通入B相，其中B相为80％ACN+0.1％‑5％FA+20％H2O将标记完成的肽段洗脱下来进行后续液质联用分析，液相色谱的分离梯度为90min，质谱采用HCD模式进行离子碎裂；质谱分析所产生的.raw文件使用mascot distiller软件进行搜库分析，搜库结果中以精氨酸结尾的肽段直接使用mascot distiller软件进行定量；以赖氨酸结尾的肽段使用“force‑find”程序进行定量。