[发明专利]一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的方法

摘要

本发明公开了一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的方法，根据发根农杆菌转化再生的植株通常具备株型矮化的特点，利用发根农杆菌MSU440转化多胚品种早金甜橙，诱导出毛状根后通过毛状根生芽及再生芽生根途径获得完整再生植株，最终培育出适合省力栽培的矮化品种，从而提高了果园劳动效率，降低了劳动消耗。本发明转化受体材料为早金甜橙无菌苗上胚轴，由于甜橙为多胚品种，因此再生植株可以保留亲本的优良品质。

主权项

一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的方法，包括以下步骤：1）早金甜橙无菌苗准备：早金甜橙果实中取出种子，自来水冲洗后于1M NaOH溶液中浸泡10min，流水冲洗去除果胶；采用3％ v/v的次氯酸钠溶液浸泡消毒15‑20min，剥去内外种皮后播种于MT播种培养基上，24‑26℃暗培养4四周后，取出1500－2000lx光照5－7天，待稍转绿后挑选健壮无菌苗用于转化；2）.发根农杆菌菌液准备：取‑80℃保存的发根农杆菌MSU440菌株在LB固体培养基上划线，28℃暗处倒置培养36－48h获得活化单菌落，挑取活化的发根农杆菌单菌落，LB固体培养基上再次划线，28℃暗培养36－48h，刮取培养好的菌体于MT悬浮培养基中，180rpm、28℃振荡培养1.5－2h后将菌液OD600值调至0.6－0.8后待用；3）外植体侵染与毛状根诱导：切取上胚轴切段在农杆菌菌液中侵染20‑30min，灭菌滤纸上吸干，转至MT共培养基上，21℃暗处共培养3d，将外植体用无菌水漂洗3次，滤纸吸干后转接于含400µg/L头孢霉素的MT基本培养基上24‑26℃暗处诱导毛状根并除菌；4）毛状根继代培养：毛状根伸长至2cm时，切下1‑1.5cm带根尖切段继代至含400mg/L头孢霉素的MT基本培养基上，20d继代1次，24‑26℃ 暗处连续继代培养2‑3次；5）毛状根生芽：将毛状根切成1cm切段，转至生芽培养基上，24‑26℃，每日16h 光照，1500－2000lx；8h暗处理条件下下诱导生芽；6）再生芽伸长：再生芽体生长至0.5－1cm时，转至芽伸长培养基；7）再生芽生根：芽体生长至1.5cm时，单独切离转至MT生根培养基诱导生根，两周可见切口发出不定根；所述的培养基如下：MT播种培养基：MT+25g/L 蔗糖+8g/L 琼脂；MT悬浮培养基：MT+0.5g/L麦芽提取物+1.5g/L谷氨酰胺+40g/L蔗糖+20mg/L乙酰丁香酮；MT共培养培养基：MT+40g/L蔗糖+8g/L琼脂+20mg/L乙酰丁香酮；毛状根诱导培养基：MT+40g/L蔗糖+8g/L琼脂+400mg/L 头孢霉素；毛状根生芽培养基：MT+40g/L蔗糖+8g/L琼脂+1mg/L BA；芽伸长培养基：MT+30g/L 蔗糖+8g/L琼脂+0.1mg/L BA+0.1mg/L IAA+0.25mg/L GA3；MT生根培养基：1/2MT+25g/L 蔗糖+8g/L琼脂+0.5mg/L NAA+0.1mg/L IBA+0.5g/L 活性炭；LB固体培养基：酵母提取物5g/L，胰化蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L 。