[发明专利]一种耐胃酸EGFP标记大肠杆菌BL21消化道示踪菌制备方法

摘要

本发明提供的一种耐胃酸EGFP标记大肠杆菌BL21消化道示踪菌制备方法，以EGFP作为荧光标记物标记，并用耐酸性材料海藻酸钙微囊化包被后，作为一种示踪剂，通过体外模拟消化道内环境，研究微囊化缓、控释制剂在体内的消化代谢规律。该示踪剂，尤其对兽类体内的消化代谢规律研究，具有重要的实践价值。

主权项

一种EGFP标记大肠杆菌BL21消化道示踪菌制备方法，参照GenBank中EGFP序列，用Oligo6.0设计一对引物，由北京华大基因合成如下：Sense：5＇‑CGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG‑3＇，Anti‑sense：5＇‑GTCGTCGACGCTTGTACAGCTCGTCCATG‑3＇；经EGFP序列的PCR扩增，用DNA纯化试剂盒回收后待用；其特征在于：分步骤实施；步骤1原核表达载体PET28a‑EGFP的构建其1EGFP片段和PET28a质粒经BamH I和Sal I双酶切后，切胶纯化回收目的基因和载体片段，用T4DNA Ligase16℃恒温过夜连接，转入BL21感受态细胞中，涂布于LB固体培养基，即含Kan，50μg/ml，正置20min后，37℃培养12h；其2EGFP扩增产物的双酶切反应体系及反应条件：10×H Buffer2.0μl，BamHⅠ1.0μl，SalⅠ酶1.0μl，pGM‑EGFP质粒5.0μl，加ddH2O补足至20.0μl；37℃水浴4h；其3PET28a质粒双酶切体系及反应条件：10×H Buffer2.0μl，BamH Ⅰ1.0μl，SalⅠ酶1.0μl，pGM‑EGFP质粒7.0μl，加ddH2O补足至20μl；37℃水浴4h；其4连接体系及反应条件：pGM‑EGFP质粒双酶切纯化回收产物1.0μl，PET28a质粒双酶切纯化回收产物5.0μl，10×T4DNA Ligase Buffer1.0μl，T4DNALigase1.0μl，加ddH2O补足至10.0μl；混匀后16℃,水浴12h；步骤2SDS‑PAGE电泳蛋白诱导表达：SDS‑PAGE电泳为诱导阳性，出现29.2KDa的His‑tag‑EGFP融合蛋白特异性条带；步骤3显微镜检测EGFP基因表达：40倍暗视野UV激发下，平板上的菌落发绿色荧光；步骤4GFP标记稳定性：30代次中菌体生长良好，仍能在12h内长出较大的菌落，其Kan抗性维持在50mg/L；步骤5EGFP BL21重组菌微囊包被：将GFP标记的重组菌以2%接种到LB液体培养基内，37℃，150rpm振荡培养至OD=1.60，然后将菌液加至2‑3%海藻酸钠溶液中，并加入6%吐温80，3000rpm，搅拌30min；将配制的海藻酸钠溶液、乳化剂、保护剂及灭活菌液依次加入组织捣碎机高速乳化10min，将乳化好的溶液置于高压均质机中10000rpm、50‑60℃、均质30min，将脱气后的均匀乳状液通过内径约为0.8mm的硅胶管，连通蠕动泵以50‑70ml/min的速度泵入喷雾干燥机内进行喷雾干燥。