[发明专利]抗猪圆环病毒2型的表达载体和转基因猪及其构建方法

摘要

本发明公开了一种抗猪圆环病毒2型的表达载体和转基因猪及其构建方法，属于基因工程领域。所述表达载体是通过分别将H1启动子和pPB-sh2序列连接到pUC57-H1质粒上，再将含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段连接到pPB-H1-sh2上构建得到的。将该载体导入猪的基因组，并采用体细胞核移植技术生产出转基因猪。本发明的表达载体具有piggyBac转座子，极大地提高了转基因效率，且将普通质粒串联重组的转基因整合模式变成了单位点单拷贝整合，更好的模拟生物基因的内环境。构建的转基因猪通过自身合成siRNA来降解PCV2mRNA，可从根本上抑制猪圆环病毒2型的感染。

主权项

一种抗猪圆环病毒2型的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、用XhoI和EcoRI酶切SEQ ID NO:1的H1启动子和质粒pCyL50，纯化，连接，转化感受态细胞，培养后挑选单克隆菌落进行扩大培养，筛选阳性克隆，酶切鉴定，得到pPB‑H1质粒；(2)、以SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3作为模板及引物进行重叠PCR扩增得到序列号为SEQ ID NO:4的pPB‑sh2序列，按步骤(1)相同的方法将pPB‑sh2序列连接到pPB‑H1质粒上，得到序列号为SEQ ID NO:11的shRNA分子pPB‑H1‑sh2；(3)、分别以质粒pcDNA3.1(+)和pT2AL200R175‑CAGGS‑EGFP为模板，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物进行第一次PCR扩增，纯化得到neo基因和EGFP；各取10ng‑200ng混合后作为模板进行第二次PCR扩增，纯化得到neo‑EGFP融合基因；用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切pcDNA3.1(+)和neo‑EGFP融合基因，纯化回收酶切产物，连接，构建得到pcDNA3.1‑Neo‑T2A‑EGFP载体；(4)、以SEQ ID NO:13的质粒为模板，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10为引物，PCR扩增出含有loxP‑Neo/EGFP基因表达盒的融合片段；按步骤(1)相同的方法将含有loxP‑Neo/EGFP基因表达盒的融合片段连接到pPB‑H1‑sh2上，得到抗猪圆环病毒2型的表达载体：pPB‑H1‑sh2‑CMV‑Neo/EGFP，序列号为SEQ ID NO:12。