[发明专利]一种卷烟烟气致细胞DNA损伤的定量评价方法

摘要

一种卷烟烟气致细胞DNA损伤的定量评价方法，属于卷烟烟气基因毒性的毒理学评价技术领域，其特征在于：是基于量子点标记荧光免疫法对烟气诱导的细胞DNA损伤标志物磷酸化的组蛋白（γH2AX）的定量测定方法；具体步骤包括：（1）细胞培养，（2）卷烟烟气染毒，（3）基于量子点标记荧光免疫法对细胞中γH2AX定量测定，（4）数据处理。本发明的优点在于：通过细胞固定和通透实现细胞样本的直接、高通量检测，省去了蛋白质提取步骤，提高检测速度；可实现96个样品的同时测定，具有高通量的优势。通过测定细胞中总H2AX的荧光信号可消除各检测孔中由细胞个数差异引起的信号偏差，减小平行样本荧光检测信号的偏差，提高方法重现性。

主权项

1.一种卷烟烟气致细胞DNA损伤的定量评价方法，其特征在于：是基于量子点标记荧光免疫法对烟气诱导的细胞DNA损伤标志物磷酸化的组蛋白（H2AX）的定量测定方法；具体步骤如下：1)、细胞培养：人肺癌细胞A549细胞株培养于以1640培养基为溶剂的细胞培养基中，然后将细胞置于37℃，5％C0₂培养箱中培养，当细胞汇合率达70%-80%时，用0.25％胰蛋白酶消化法进行细胞接种；96孔板的最外周36个孔中每孔加入100μl生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100μl细胞悬液，最终细胞接种密度为5000个/孔，于37℃、5%CO₂条件下培养24h；2)、细胞染毒：使用细胞培养基将烟气总粒相物萃取液或烟气气相物吸收液调整到不同浓度，设置7个非零浓度，细胞培养24h后，吸去培养液，96孔板（除最外周36孔）每列6孔为一组，分别设置7个不同浓度的烟气染毒组和空白对照组处理，烟气染毒组每孔加入100μl不同浓度梯度的烟气粒相物萃取液或烟气气相物吸收液，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100μl稀释培养液作为空白对照，于37℃、5%CO₂条件下培养24h；3)、基于量子点标记荧光免疫法对细胞中H2AX定量测定：(1)细胞固定：细胞染毒24h后，小心移去培养基，用Tris缓冲液洗涤两次，每次至少5min，以除去化合物染毒溶液，采用1%中性甲醛固定细胞；(2)固定好的A549细胞用Tris缓冲液洗涤2次，加入通透液室温孵育20min；(3)Tris缓冲液洗涤3次，滴加2%BSA封闭液，在37℃湿盒中孵育30min；(4)加入100μl含有兔抗人H2AX抗体和小鼠抗人H2AX抗体组成的一抗混合液，在37℃恒温培养箱中孵育2小时或4℃过夜；(5)Tris缓冲液洗涤3次，加入量子点标记混合二抗溶液，在37℃恒温培育2小时；(6)向微孔板中加入100μL的Tris缓冲液，经荧光酶标仪（405nm处激发，在525nm和605nm处检测）测定荧光强度值；4)、数据处理：试验中设置空白对照组，即不加入一抗抗体，仅加入量子点标记的二抗抗体，所检测信号即为由非特异性吸附引起的空白信号；所有样品测试孔的检测信号应扣除空白信号；最后，根据目标物H2AX与总H2AX含量的比值和化合物染毒浓度绘制剂量效应曲线。