[发明专利]一种制备间充质干细胞的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，本发明公开了一种制备间充质干细胞的方法，该方法以新生儿的脐带为原料，通过脐带预处理、冻存组织、复苏组织、分离原代间充质干细胞、扩增间充质干细胞的方法，该方法具有工业化简单、易于操作等优点，利用本发明方法可以大量冻存脐带组织，在临床有需要时对组织复苏以制备间充质干细胞，与现行的直接分离出间充质干细胞并进行细胞冻存相比，本方法可以充分保存脐带组织内最原始的间充质干细胞，既可大步降低保存成本，又可避免间充质干细胞在体外经多次传代导致其分化而影响其临床应用。

主权项

一种制备间充质干细胞的方法，其特征在于： （1）脐带预处理 取新生儿新鲜脐带，结扎脐带两端，放入含有100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI‑1640培养液100ml中，在4℃～12℃运输；在百级超净台取出脐带，用70%～75%医用酒精浸泡脐带，浸泡时间30s～60s，去除脐带结扎两端外侧，中间段剪成1～2cm长的小段，用生理盐水反复冲洗脐带小段，剖开，去除其动脉、静脉，用生理盐水反复冲洗去除血迹，剪碎至0.5～2mm3，得到脐带组织小块，冷藏于0～5℃中； （2）脐带组织块冻存处理 取出冷藏于0～5℃中的脐带组织小块，放入冷藏于0～5℃中的组织冻存保护液内，脐带组织小块与组织冻存保护液的质量与体积的比为0.5～1.5:0.5～1.5，得到组织块悬液，分装组织块悬液至冻存管中，将冻存管放置在冻存盒内，在0～5℃冷藏20分钟～40分钟，在零下80℃冻存4小时～6小时，最后放入零下196℃保存； （3）脐带组织块复苏处理 取出零下196℃冻存的脐带组织冻存管，投入37℃～40℃的温水中，解冻后，在百级超净台上将组织块悬液移至离心管中，加入3～6倍组织块悬液体积的生理盐水冲洗，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟，去掉液体；离心管中加入生理盐水，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟，去掉液体，反复操作1～2次，去掉液体，保留组织块固体； （4）分离原代间充质干细胞 方法一（组织块贴壁法）：将步骤（3）组织块固体接种至细胞培养瓶中，每1～1.5平方厘米放置1块组织块固体，培养瓶放置在37℃、5%二氧化碳、饱 和湿度的细胞培养箱中静置3～5小时，向培养瓶内加入培养液，放置在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中，继续培养8～12天，取出培养瓶中组织块固体，弃去；细胞培养瓶中再加入培养液，在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中培养3～5天后，吸弃培养瓶中培养液，用pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，吸弃洗涤液，加入0.125%～0.25%胰蛋白酶‑EDTA消化液1～3ml，静置消化1～3分钟，加入与消化液等体积的胎牛血清（FBS）终止细胞消化作用，再加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml～40ml，即得间充质干细胞悬液，转移细胞悬液至50ml离心管内，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～10分钟，去掉液体，得到的沉淀物即为原代间充质干细胞； 方法二（酶消化法）：向步骤（3）组织块固体内加入其3～5倍体积的0.05%～0.2%Ⅱ型胶原酶消化液，放入37℃恒温摇床内震荡消化，100转/分钟～150转/分钟，1～3小时；将消化液用100μm细胞筛网过滤，再将过滤液离心，2000转/分钟～2500转/分钟，离心15分钟～20分钟，吸弃上清液，保留沉淀；加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml～40ml重悬沉淀，1500转/分钟～2000转/分钟，离心10分钟～15分钟，吸弃上清液，保留沉淀；加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml～40ml重悬沉淀，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～10分钟，吸弃上清液，得到的沉淀物即为原代间充质干细胞； （5）扩增间充质干细胞 取原代间充质干细胞与培养液混匀，接种至细胞培养瓶，接种后24小时更换培养液，以后每3天更换一次培养液；细胞贴满培养瓶底80%以上时，吸弃培养瓶内旧培养液，吸取pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）反复浸洗培养瓶底壁贴壁细胞，吸弃洗涤液；加入0.125%～0.25%胰蛋白酶‑EDTA消化液1～3ml，静置消化1～3min，加入与消化液等体积的胎牛血清（FBS）终止细胞消化 作用，再加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml～40ml，即得间充质干细胞悬液；转移细胞悬液至50ml离心管内，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～10分钟；吸弃上清液，沉淀加入15～30ml培养液重悬，分装细胞悬液至3个～5个细胞培养瓶，各瓶补加10～20ml培养液。待细胞铺满瓶底80%以上时，按照上述方法继续传代，即为扩增间充质干细胞。