[发明专利]一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建

摘要

本发明涉及一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建。采用的技术方案是：(1)PCR扩增GST标签蛋白序列、SacR调控序列以及目的蛋白序列；(2)PCR产物与载体pHY300-PLK连接，构建重组质粒；(3)重组质粒转化枯草芽孢杆菌WB600，蔗糖诱导蛋白表达，得到融合蛋白。本发明通过PCR扩增、酶切、连接、转化和筛选，证实未加蔗糖诱导之前，仅有极低的痕量融合蛋白表达，诱导后32小时得到高效表达的融合蛋白，该融合蛋白通过对目的蛋白的抑菌效果检测以及针对GST标签蛋白的Western-Blot检测实验确定两种蛋白正确融合与表达。

主权项

一种大肠杆菌‑枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建，其特征在于方法如下：1）SacR调控序列的制备：提取枯草芽孢杆菌基因组；根据NCBI公布的SacB序列，以提取的枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计上下游引物pS1及pS2，在两端分别添加Xba I和Nde I酶切位点，PCR扩增获得SacR调控序列；所述的上游引物pS1的序列为GCGTGCTCTAGAGATCCTTTTTAACCCATC；所述的下游引物pS2的序列为GAATTCCATATGCGCAAACGCTTGAGTTG；2）制备GST标签蛋白序列；3）获得目的蛋白序列；4）各元件的连接以及与载体的连接：连接经Quick Cut Nde I内切酶处理的SacR片段与GST片段，得到SG序列，经Quick Cut Vsp I酶切后与同样经Quick Cut Vsp I酶酶切的目的蛋白序列片段进行连接，得到重组序列；将重组序列和提取质粒pHY300‑PLK分别经Quick Cut Hind III和Quick Cut Xba I 双酶切后连接，得到重组质粒；5）重组质粒的转化：将重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中；6）目的蛋白在枯草芽孢杆菌WB600中的诱导表达：选取5）步获得的阳性转化子接种于含有Tetracycline的LB液体培养基中，37℃、200rpm活化2h，之后以1%接种量接种于含有Tetracycline的LB液体培养基中，37℃、180rpm震荡3h，12000rpm离心10min后取上清液，上清液中加入20%蔗糖溶液作为诱导剂至终浓度为2%，持续诱导48h，12000rpm离心10min，取上清，得融合多肽。