[发明专利]复制缺陷型BmNPV载体的构建及应用

摘要

本发明公开了利用同源重组的方法构建穿梭载体BmBacmid，进而通过Red重组技术构建了一种复制缺陷型的BmNPV载体。复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法具体为：首先构建家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid，再利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orf1629的部分序列，从而构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid；该复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid可以快速构建重组病毒表达目的蛋白。上述复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的用途是用于构建重组病毒表达目的蛋白。

主权项

转移载体pMD18‑lef2‑BAC‑1629的构建方法，其特征是包括以下步骤：1）、pMD18‑lef2‑1629载体构建：①、分别进行BmNPV lef2基因片段和orf1629基因片段的合成，②、利用BmNPV lef2基因片段和orf1629基因片段重叠PCR合成lef2‑1629片段；③、构建pMD18‑lef2‑1629：先对lef2‑1629片段3'端加“A”，所得的加“A”后的PCR产物连接到T载体，得pMD18‑lef2‑1629；2）、转移载体pMD18‑lef2‑BAC‑1629的构建：①、细菌人工染色体BAC片段的合成以bMON14272DNA作为模板，利用KOD FX DNA聚合酶PCR扩增BAC片段，得BAC片段PCR产物；②、BAC片段克隆到pMD18‑lef2‑1629：先将pMD18‑lef2‑1629与BAC片段PCR产物分别用FseI进行单酶切反应；pMD18‑lef2‑1629酶切产物割胶回收后去磷酸化，再与酶切回收的BAC片段PCR产物用DNALigation Kit LONG试剂盒进行连接，连接产物转化HST08感受态细胞，得转移载体pMD18‑lef2‑BAC‑1629。