[发明专利]基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法

摘要

本发明公开了一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法，所述方法包括培养基的制备、固态发酵、粗酶液的制备、酶催化反应、DNS法分析还原糖生成量等步骤，所述DNS法是采用2,4-二硝基水杨酸即DNS分析所述酶催化反应的还原糖生成量，即取0.2mL反应液与0.6mLDNS溶液混合，摇匀，100°C水浴15min，随即取出用自来水冷却，再用蒸馏水定容至5mL，于520nm波长下测定吸光值，依据标准曲线来计算反应液中还原糖的生成量。本方法可实现快速优化柚苷酶催化柚皮苷的目的，并进一步优化了催化条件，在此条件下，柚皮苷的转化率得到了很大的提高。

主权项

一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法，其特征在于：本方法包括以下步骤：步骤一、培养基的制备：所述培养基的制备包括斜面培养基的制备及固态培养基的制备，其中：所述斜面培养基的制备，按以下质量体积浓度的组分制备：MgSO4·7H2O 1.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，(NH4)2SO4 1.5 g/L，KCl 0.5 g/L，KNO3 1.5 g/L，无水 CaCl2 0.1 g/L，酵母提取物 2.0 g/L，柚皮苷 2.5 g/L，琼脂 20 g/L，初始 pH 6.0，1×105 Pa 灭菌20 min；所述固态培养基的制备，按以下重量的组分制备：柚皮粉160g，豆饼粉24g，麸皮1%，KNO3 1%，固水比为1:1.5，1×105 Pa灭菌20 min；步骤二、固态发酵：将棘孢曲霉菌种接种于所述斜面培养基上，28°C培养3‑4d，使所述斜面培养基上长满孢子，用无菌生理盐水洗下孢子，并用无菌生理盐水调整菌悬液OD值至0.2，将1 mL单孢子菌悬液接入装有所述固态培养基的250 mL的三角瓶中，每瓶装样量为5 g，于28°C下培养7‑8 d；步骤三、粗酶液的制备：以1:20的固液比，用磷酸盐缓冲液对固态发酵物进行浸泡1 h，搅匀后抽滤并收集滤液，将所述滤液于4°C以12000×g离心10 min，收集上清液即得粗酶液，于0‑4°C下保藏备用；步骤四、酶催化反应：所述酶催化反应为游离柚皮苷的酶催化反应和/或固定化柚皮苷的酶催化反应，其中，所述游离柚皮苷的酶催化反应为：在50 mL的反应体系中，柚皮苷浓度为0.04‑0.24g/100 mL，酶用量为4‑12 U/mL，以浓度为 0.02 mol/L醋酸‑醋酸钠溶液为缓冲液，反应pH 值为3.0‑7.0，置于恒温振荡水槽中，反应温度为30‑70ºC，振荡反应4 h，振速为0‑160次/min，从加入酶液开始计时，每30 min取反应液一次，沸水灭活后，冷却至室温；所述固定化柚皮苷的酶催化反应为：在50 mL的反应体系中，加入1 g湿重的树脂，柚皮苷浓度为0.08‑0.24g/100 mL，酶用量为4‑12 U/mL，以浓度为 0.02 mol/L醋酸‑醋酸钠溶液为缓冲液，反应pH 值为3.0‑7.0，置于恒温振荡水槽中，反应温度为30‑70ºC，振荡反应4 h，振速为0‑160次/min，期间从加入酶液开始计时，每隔一段时间取反应液一次，并立即用沸水浴灭活20 min，冷却至室温；在其他条件不变的情况下，分别对所述的柚皮苷浓度、酶用量、反应pH值、反应温度及振速进行单因素试验，以确定最佳反应条件；步骤五、DNS法分析还原糖生成量：采用2, 4‑二硝基水杨酸即DNS分析所述酶催化反应的还原糖生成量：取0.2 mL所述反应液与0.6 mL DNS溶液混合，摇匀，100°C水浴15 min，随即取出用自来水冷却，再用蒸馏水定容至5 mL，于520 nm波长下测定吸光值，依据标准曲线来计算反应液中还原糖的生成量，其中，绘制标准曲线时，以等摩尔比的鼠李糖和葡萄糖组成的混合溶液为标准溶液，其浓度为0‑2 mg/mL。