[发明专利]VBNC状态啤酒易感乳酸菌的诱导及复苏方法

摘要

本发明属于食品微生物培养和检测领域，涉及两种诱导啤酒易感乳酸菌进入“活的但不可培养”（viable but non-culturable，VBNC）状态的方法以及将该VBNC状态下易感乳酸菌复苏至正常状态的方法和应用。其中两种诱导方法分别为，一是通过0～4℃低温储藏；二是通过啤酒环境下连续传代驯化培养，这两种方法均可获得处于VBNC状态下的啤酒易感乳酸菌。另外，本发明还包括一种通过添加过氧化氢酶促进VBNC细菌生长的复苏方法。VBNC状态啤酒易感乳酸菌的诱导及复苏研究对找到逃避检测的“隐形”污染源，提高啤酒检测结果的准确性和检测效率具有十分重要的意义，并为啤酒易感乳酸菌的预防监控奠定基础。

主权项

一种VBNC状态啤酒易感乳酸菌的诱导方法，其特征在于：该诱导方法包括如下步骤：1）原始菌株的培养将啤酒易感乳酸菌采用MRS固体培养基进行纯化复壮，挑取固体平板上较大的菌落接种于液体MRS培养基中培养；2）采用低温储藏工艺进行VBNC状态菌的诱导取耐乙酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）2011‑8培养物放入冰箱内保存，并且每隔7天进行一次MRS平板计数，本试验重复三次且设定正常培养下的L.acetotolerans2011‑8为对照组，直至平板25‑28℃厌氧培养14天无单菌落出现，此时可认为该菌不可培养，下同；3）VBNC状态菌的检测，该检测方法包括以下步骤：a）首先测定细菌总数将新鲜培养的菌液进行10倍系列稀释，取适当浓度的稀释液加终浓度2%的甲醛固定，再取1mL固定后的稀释液加吖啶橙溶液染色，再将黑色微孔滤膜置于无自发荧光的载玻片上，取适量样品滴于滤膜上，待菌液略干盖上载玻片并压紧，在载玻片上滴一滴无自发荧光的香柏油，用荧光显微镜于暗室中观察并计数；b）采用试剂盒检测细菌活性取1mL计数平板上无单菌落存在的培养物于7000g离心5min，用无菌生理盐水洗涤两次，尽可能地除去细菌培养液，以免培养基产生自发光而干扰观察结果；再加入50μL的无菌蒸馏水重悬菌体沉淀，加入各25μL的绿色染料和红色染料，吹吸混匀后避光染色15‑20min；取适量样品滴于无自发荧光的载玻片上，盖上载玻片，并在载玻片上滴1滴无自发荧光的香柏油，用荧光显微镜于暗室中观察并计数。