[发明专利]一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法

摘要

本发明公开了一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法，主要包括以下步骤：1)棉花主要病原真菌菌丝基因组DNA提取，包括大丽轮枝菌、黑白轮枝菌、立枯丝核菌、串珠镰刀菌、粉红单端孢和尖孢镰刀菌；2)核糖体内部转录间隔区(ITS)PCR扩增，使用真菌ITS通用引物ITS4和ITS5进行快速扩增；3)限制性内切酶酶切反应，及带谱鉴别，任意使用识别位点为四碱基的内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A对上述棉花主要病原真菌的ITS产物进行单酶切，比对ITS-RFLP带谱对比表和标准电子图谱，从而快速鉴定出病原菌的类别。本发明较传统的费时费力形态学生理学鉴定，以及高成本的ITS克隆测序鉴定病原菌方法而言，具有快速、准确、经济且可以同时鉴定多种病原真菌的优点。

主权项

一种棉花主要病原真菌ITS‑RFLP快速鉴定方法，选择棉花主要病害的病原真菌，包括棉花黄萎病、枯萎病、立枯病、红腐病和红粉病所对应的病原菌大丽轮枝菌、黑白轮枝菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、串珠镰刀菌和粉红单端孢，并测定以上病原真菌的ITS序列；利用Webcutter在线分析选择酶切带谱类型各异的限制性内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A，结合pDRAW32软件，对酶切产物分布情况进行分析，并绘制出2‑4％的琼脂糖凝胶电子酶切图谱，作为比对使用的标准图谱；随后提取待测棉花样品的病原真菌的基因组DNA，采用如下引物对所提取的DNA进行PCR扩增；ITS4：5’‑TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC‑3’：ITS5：5’‑GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G‑3’：扩增产物使用限制性内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A分别酶切，并采用与前述琼脂糖凝胶相同浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，并将酶切结果和电子标准图谱比对，鉴定病原真菌种类。