[发明专利]一种表达嗜热内切葡聚糖酶的重组毕赤酵母的构建方法

摘要

一种表达嗜热内切葡聚糖酶的重组毕赤酵母的构建方法，涉及一种微生物重组构建方法。首先通过引物设计扩增嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶基因，然后采用NotI和XhoI双酶切目的基因与载体pPICZα-A，获得重组载体pPICZα-A-ph1171-sgc-mut-sd，然后采用限制性内切酶SacI线性化质粒，电转化感受态酵母细胞，经培养后挑选转化子分别对应点种到MM、MD平板，并利用Zeocin™获得多拷贝重组子，最后经甲醇诱导，并于48、72h取样,经SDS-PAGE分析，结果表明整合嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶的毕赤酶母工程菌株构建成功。所述嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶对纺织工业中尤其生物抛光（尤其棉制品）领域具有重要意义。

主权项

一种表达嗜热内切葡聚糖酶的重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1）以携带有嗜热葡聚糖酶基因的质粒pET21a(Amp+)‑ ph1171‑sgc‑mut‑sd为模板，进行PCR扩增，引物：5’1171SD‑XhoI‑F   5’‑CACTACCTCGAGAAAAGAATGGAAAATACAACATATCAA‑3’3’1171SD‑NotI‑R   5’‑TGGGATGCATGCGGCCGCTCAAGAACTTTTGGAACAA‑3’在嗜热内切‑β‑1，4‑葡聚糖酶基因两端分别引入Xho I和Not I两个酶切位点，使用Tli DNA聚合酶扩增得到大小为1168 bp的嗜热内切‑β‑1，4‑葡聚糖酶基因；2）将上述通过PCR扩增得到的嗜热内切‑β‑1，4‑葡聚糖酶基因及质粒pPICZα‑A经Xho I和Not I双酶切回收后，再经T4 DNA连接酶连接，插入到pPICZα‑A的多克隆位点，转化大肠杆菌DH5α，在ZeocinTM LB平板上筛选阳性转化子并测序；3）将测序正确的阳性克隆培养，大量提取质粒后，采用Sac I线性化并使用乙醇沉淀线性化产物，用于毕赤酵母转导；4）重组表达载体pPICZα‑A‑ph1171‑sgc‑mut‑sd经Sac I完全酶切线性化后，电转化巴斯德毕赤酵母 X33并涂布ZeocinTM YPDS平板，30 ℃孵育平板3至7天，对转化子进行Mut表型鉴定，得到Mut+菌株；5）将Mut+表型的转化子点种到ZeocinTM （2000 µg/ml）YPDS平板，30℃孵育2天，筛选得到抗高浓度ZeocinTM水平的重组酵母多拷贝重组子；6）将上述抗高浓度ZeocinTM水平的重组酵母多拷贝重组子接种于25 ml BMGY培养基（250 ml摇瓶）中，在30℃、250 rpm下培养至OD600=3，然后在室温、1500‑3000 g条件下，离心5分钟，收集细胞，去除上清，用BMMY培养基重悬细胞至OD600=1；7）利用甲醇诱导表达72小时；其间每24小时补加甲醇至终浓度为0.5%，每12小时取样1 ml，在室温、最大转速离心条件下，离心2分钟，将上清转移至单独管中，利用考马斯亮蓝染色的SDS‑PAGE分析重组蛋白的表达。