[发明专利]羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA及制备方法与应用

摘要

本发明公开一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA及制备方法与应用。本发明通过以羊布鲁氏菌M5基因组DNA为模板，PCR扩增得到znuA基因的上、下游同源臂；将znuA基因的上、下游同源臂连接，得到片段ΔznuA；将片段ΔznuA克隆至载体pRE112上，得到自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA；将该质粒导入羊布鲁氏菌M5细胞中，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子，再将同源重组单交换子涂布于选择培养基上，得到羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA。该菌株较M5菌株，具有良好的生长特性和遗传稳定性，毒力小且免疫效果相当，因此，其有望成为新型疫苗进行应用。

主权项

一株羊布鲁氏菌重组菌株M5‑ΔznuA的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）自杀性同源重组质粒的构建①以羊布鲁氏菌（Brucella melitensis）M5基因组DNA为模板进行PCR，使用的引物为P1和P2时，得到znuA基因的上游同源臂；使用的引物为P3和P4时，得到znuA基因的下游同源臂；P1：5′‑GATGGTACCCGTCCTCGTTTGCTTGTGC‑3′；P2：5′‑TCGCTGAAAGACTGCCTGT‑3′；P3：5′‑GCAGTCTTTCAGCGAAGCCAGAAAGGCAGAAGC‑3′；P4：5′‑AGAGAGCTCCAATGTCCCCTTGGTCCC‑3′；②利用Overlap PCR的方法，以步骤①中制备的znuA基因的上游同源臂和znuA基因的下游同源臂为模板，P1和P4为引物对，得到用于同源重组的目的片段ΔznuA；③用KpnI和SacI分别对自杀性质粒载体pRE112和用于同源重组的目的片段ΔznuA进行双酶切，纯化；将纯化回收的片段ΔznuA和载体片段pRE112连接，得到自杀性同源重组质粒pRE‑ΔznuA；（2）羊布鲁氏菌重组菌株的构建及筛选①将自杀性同源重组质粒pRE‑ΔznuA导入羊布鲁氏菌M5的感受态细胞中；接着涂布于含有氯霉素的TSA‑YE平板上，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子；将PCR鉴定正确的同源重组单交换子在TSB‑YE培养基中培养，松弛质粒抗性；②接着将松弛质粒抗性后的同源重组单交换子涂布于TSA‑YE‑Sucrose选择培养基上培养，利用自杀性同源重组质粒pRE‑ΔznuA中sacB基因对蔗糖的敏感性，对自杀质粒进行消除，利用引物P1和P4对TSA‑YE‑Sucrose选择培养基上生长的菌落进行PCR筛选，获得同源重组双交换子，即得到羊布鲁氏菌重组菌株M5‑ΔznuA；所述的TSA‑YE‑Sucrose选择培养基的组成如下：胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基+终浓度为质量体积比7%的蔗糖。