[发明专利]一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法

摘要

本发明公开了一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法，该热带植物多糖多酚小RNA提取方法包括以下步骤：采样热带植物叶片，冻入液氮，‑80℃保存；准备小RNA提取的试剂，CTAB裂解缓冲液、PEG8000沉淀缓冲液、EDC交联缓冲液、miRNA Northern blotting杂交缓冲液、7%dPAGE、Washing Buffer；按照小RNA提取的预处理、Trizol抽提、分级沉淀高分子量RNA、沉淀小RNA，提取小RNA；按照17%dPAGE分离、转膜及交联、miRNA杂交及洗膜、小RNA杂交及洗膜、曝光及保存，实现RNA杂交；miRNA stem‑loop RT‑PCR扩增；开展多糖多酚植物小RNA的提取以及检测分析。本发明克服了目前植物小RNA提取方法的不足，具有快速、稳定、操作简便的特点，可以针对miRNA和siRNA进行快速提取和检测分析，具有广泛的应用前景。

主权项

一种提取多糖多酚热带植物中小RNA的方法，其特征在于，该提取多糖多酚热带植物中小RNA的方法包括以下步骤：步骤一、采样热带植物叶片，冻入液氮，‑80℃保存；步骤二、准备小RNA提取的试剂，CTAB裂解缓冲液、PEG 8000沉淀缓冲液、EDC交联缓冲液、miRNA Northern blotting杂交缓冲液、7％dPAGE、Washing Buffer；步骤三、按照小RNA提取的预处理、Trizol抽提、分级沉淀高分子量RNA、沉淀小RNA，提取小RNA；步骤四、按照17％dPAGE分离、转膜及交联、miRNA杂交及洗膜、小RNA杂交及洗膜、曝光及保存，实现RNA杂交；步骤五、miRNA stem‑loop RT‑PCR扩增；步骤六、开展多糖多酚植物小RNA的提取以及检测分析；在步骤二中，提取小RNA的试剂如下：CTAB裂解缓冲液：4M异硫氰酸胍，2％w/v CTAB，100mM Tris‑HCL pH 8.5，25mM EDTA，2M NaCl，2％w/v PVP‑40，and 2％v/v 2‑巯基乙醇；PEG 8000沉淀缓冲液：20％w/v PEG 8000，1M NaCl；EDC交联缓冲液12ml：122.5μl 12.5M 1‑甲基咪唑pH8.0，0.373g 1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；miRNA Northern blotting杂交缓冲液：5×SSC，20mM NaHPO4pH7.2，7％SDS，3×Denhardt`s溶液；17％dPAGE：尿素12.6g，水1.25ml，10×TBE 1.5ml，Acr/Bis 30％17ml，在微波炉中溶解尿素，待冷却后加入240μl 10％AP，混匀后再加入10μl TEMED；Washing Buffer：2×SSC，0.1％SDS；在步骤三中，小RNA提取的具体方法如下：第一步，预处理：取2g～3g叶片液氮研磨后将粉末转入DEPC处理过的50ml的离心管中，加入20ml的CTAB裂解缓冲液，涡旋不少于30s后将裂解产物放在室温3分钟～5分钟，然后12000g 4℃离心5min；第二步，Trizol抽提：离心后的上清转入一干净的50‑ml离心管，加入等体积的Trizol试剂，充分涡旋后室温放置5min～10min；加入4ml氯仿:异戊醇，氯仿:异戊醇的比值为24:1，涡旋后静置3min离心，1,2000g 4℃离心10min；第三步，分级沉淀高分子量RNA：离心后上清转入另外50ml离心管，65℃孵育15min，然后加入等体积的PEG 8000沉淀缓冲液，涡旋后马上冰浴30min～45min后离心10min沉淀高分子量RNA；第四步，沉淀小RNA：离心后的上清液加入1/10体积的3M NaAc pH5.2和2.5倍体积的预冷的无水乙醇，‑20℃沉淀过夜，1,2000g 4℃离心20min，沉淀用80％的乙醇洗涤1次～2次，DEPC水溶解后放入‑80℃备用。