[发明专利]一种克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法

摘要

本发明公开了一种克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法，包括以下步骤：提取山核桃叶片中的DNA；引物的设计及合成，接头处理；酶切；将接头与酶切片段连接；PCR扩增，PCR产物的回收；回收产物与PMD18-T载体的连接；序列测定及分析。本发明具有节约成本、简便易行的的特点，适合推广应用。

主权项

一种克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、DNA提取B.引物设计及合成根据RACE技术扩增得到的cDNA全长，利用Primer5.0设计启动子下游的特异性引物，引物序列交由上海生物工程有限公司合成：特异性引物WK‑1：AAGAGGAGTCCAAAGGTCACGGCAGWK‑2：TGAGATACCGGCCGTGCAGTAGACAWK‑3：CAGTAGACAAGGGCAAAGATCATACC通用引物由上海英潍捷基贸易有限公司引物合成，通用引物adapter‑long：GTAA TACG ACTC ACTA TAGG GCAC GCGT GGTC GACG GCCC GGGC TGGTadapter‑short：ACCAGCCCAP1：GTAATACGACTCACTATAGGGCAP2：ACTATAGGGCACGCGTGGT；C.接头处理由英潍捷基合成的接头adapter‑long和adapter‑short分别稀释成100μmol/L，混合，95℃变性5分钟，慢慢冷却至室温，‑20℃保存；D.酶切使用DraI、Stu I、Eco V和Pvu II酶切基因组DNA，电泳检测，最后用24：1的氯仿：异戊醇抽提后回收，反应体系为：5μl的100ng/μl基因组DNA，1μl的内切酶，2μl的10Xbuffer，加ddH2O至总体积为20μl；E.将接头与酶切片段连接10μl的酶切DNA，2μl的50μM接头，2μl的10Xbuffer，1μl的T4DNA连接酶，加ddH2O至总体积为20μl，16℃连接过夜；F.PCR扩增以AP1和WK1为引物进行第一轮PCR，以第一轮PCR产物为模板以AP2和WK3为引物进行巢式PCR扩增：F1在0.2ml离心管中配制下列反应液：1.0μl的连接产物，2.0μl的10×Ex Taq Buffer：Mg2+Plus，1.6μl的dNTP Mixture各2.5mM，0.4μl的引物1：10μM，0.4μl的引物2：10μM，0.2μl的TaKaRa Ex Taq：5U/μL，up to20μl的ddH2O；F2充分混匀，短暂离心：设定PCR仪，反应条件如下：94℃，3min；94℃30sec，72℃3min，循环10次；94℃30sec，67℃3min，循环25次；72℃10min，4℃保存；G.特异片段回收步骤如下：G1通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀片将目的片段DNA琼脂糖凝胶切下，放入1.5ml离心管中；G2根据胶块的重量和浓度，加400μl的Buffer B2；G3将离心管置于50℃水浴5‑10min，间混匀，直至完全溶化；G4目的片段小于500bp，加入Buffer B2体积1/3的异丙醇，混匀；G5将融化好的溶液吸入吸附柱，8000g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；G6向吸附柱加入500μl Wash solution，9000g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；G7重复步骤G6一次；G8将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心1min；G9往吸附膜中央加入20μl Elution buffer，室温静置1‑2min，9000g离心1min，将所得到的DNA溶液放入‑20℃保存或用于后续试验；H.回收产物与PMD18‑T载体的连接在PCR管中，用T‑Vector与特异性片段进行连接，操作步骤如下：H1加载体PMD18‑T1μl；H2加目的DNA片段1‑4μl；H3加Solution I缓冲液5μl；H4加水至10μl；H5在16℃下连接8小时以上；I.质粒转化I1感受态细胞冰上溶化5分钟，加入待转化的连接液或者质粒，冰上静置30min后；I242℃水浴热击60s，冰上冷却1‑2min；I3加入800μlLB培养基，200rpm、37℃振荡培养1h；I4取100μl涂板，37℃倒置培养14‑16h后挑取单菌落摇菌；I5菌液PCR；J.序列测定及分析将通过鉴定后，明确已插入目的片段的0.5ml菌液于1.5ml的离心管中，送上海生工测序；测定的序列用DNAMAN，BLAST软件搜索GenBank/NCBI/RGP中的同源序列进行比较分析。