[发明专利]一种激活素A促进原始卵泡库形成的方法

摘要

本发明涉及一种激活素A促进原始卵泡库形成的方法，操作步骤如下：1）利用体内和体外实验确定激活素A发挥作用的关键时期是出生前12天到出生后7天；2）利用细胞荧光染色和western blot检测减数分裂相关蛋白的表达情况，确定激活素A促进雌性生殖细胞第一次减数分裂的进程；3）利用免疫荧光组化的方法统计各组中原始卵泡形成情况，激活素A促进原始卵泡库的建立。本发明方法原理可靠，操作简单，激活素A在卵母细胞发生早期起重要作用，它使雌性生殖嵴中保持相对高浓度的视黄酸，视黄酸在雌性生殖细胞中促进了Stra8基因的表达，加速了雌性生殖细胞减数分裂启动及进程，促进了原始卵泡的形成。

主权项

一种激活素A促进原始卵泡库形成的方法，其特征在于按照如下步骤操作：1）利用体内和体外实验确定激活素A发挥作用的关键时期是出生前12天到出生后7天：利用机械法分离12.5dpc的胎鼠卵巢组织在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，培养液A包含88%α‑MEM，10%胎牛血清，1%丙酮酸钠，1%青链霉素，10mIU促卵泡素；培养分为四个阶段，每个阶段7天，共28天；在每个阶段分别设置不添加激活素A组，培养到28天时，收集胎鼠卵巢，并撕成碎小的组织块，0.25％胰酶，0.2％胶原酶IV，37℃处理10min，加入10%的胎牛血清+90%的DMEM配成的终止液后洗涤3次后，用口吸管收集裸卵，在磷酸盐缓冲液中反复洗涤，直至收集的样品中不再含有颗粒细胞；然后统计不同组的卵母细胞数目和直径大小；发现激活素A从小鼠出生前12天开始到出生后7天都发挥作用；2）利用细胞荧光染色和western blot检测减数分裂相关基因和蛋白的表达情况，确定激活素A促进雌性生殖细胞第一次减数分裂的进程：12.5dpc胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作：生殖嵴分离出来培养的当天定为0天，分离出的12.5dpc胎鼠生殖嵴，在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，贴壁培养4天，培养液包含88%α‑MEM，10%胎牛血清，1%丙酮酸钠，1%青链霉素，10mIU促卵泡素，100ng/ml激活素A；通过实时荧光定量PCR、细胞荧光染色和western blot检测手段，确定激活素A加速第一次减数分裂的进程；3）利用免疫荧光组化的方法统计各组中原始卵泡的形成情况，激活素A促进原始卵泡库的建立：12.5dpc胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作：分离出12.5dpc胎鼠生殖嵴，在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱里培养，培养液成分同步骤2）；每两天换半液，悬浮培养4天后转为体外立体培养6天，通过荧光免疫组化检测发现激活素A促进在体外培养条件下的原始卵泡库形成；结果表明，激活素A加速体内原始卵泡库的建立；4）激活素A对雌性生殖细胞第一次减数分裂相关基因和蛋白的影响：利用RT‑qPCR方法检测减数分裂相关基因Stra8、Dazl、Scp3、Rec8、Spoll和Dmc1的变化，激活素A处理组的Stra8表达量极显著升高，Dazl、Scp3和Dmc1表达量显著升高；借助免疫细胞化学检测技术，利用MVH标记生殖细胞后检测了生殖细胞DAZL和STRA8的阳性率，发现激活素A显著增加了表达DAZL和STRA8的生殖细胞比例；同时，Western blot结果显示，添加激活素A后，DAZL、SCP3和STRA8减数分裂相关蛋白都显著升高。