[发明专利]膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法

摘要

本发明适用于生物技术领域，提供了一种膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法。该方法包括以下步骤：载体pLVX-PD-1-IRES-ZsGreen1的构建；病毒包装；稳转株细胞的构建。该方法通过包装慢病毒再感染真核细胞，经流式细胞仪分选后得到可稳定表达PD-1抗原的细胞株，使得其能在单抗研发过程中通过结合表面表达的抗原快速筛选到具有高亲和力的单克隆抗体生产株，大量的节约单克隆筛选时间和筛选成本。

主权项

一种膜表达人PD‑1蛋白的稳转株细胞构建方法，包括如下步骤：设计含酶切位点EcoRI的引物pLVX‑PD‑1‑F和含酶切位点BamHI的引物pLVX‑PD‑1‑R，并所述药物与PD‑1的DNA序列进行PCR扩增，收集扩增产物；将慢病毒包装质粒载体pLVX‑IRES‑ZsGreen1与所述扩增产物分别进行酶切处理，分别得到pLVX‑IRES‑ZsGreen1（EcoRI+BamHI）和PD‑1（EcoRI+BamHI）酶切产物；所述pLVX‑IRES‑ZsGreen1（EcoRI+BamHI）和PD‑1（EcoRI+BamHI）酶切产物连接后转化处理，将转化产物扩增后进行质粒抽提处理，得到膜表达PD‑1的载体pLVX‑PD‑1‑IRES‑ZsGreen1；将所述膜表达PD‑1的载体pLVX‑PD‑1‑IRES‑ZsGreen1与病毒包装质粒pMD2.G和PsPAX2共转染至真核细胞中，进行病毒包装，同时对病毒滴度进行监控；当病毒滴度以MOI=2～10感染所述真核细胞时，加入终浓度为5‑8ug/ml的polybrene协助病毒；将感染病毒的所述真核细胞进行正常传代后，选取荧光阳性（细胞进行分选，并对分选的细胞进行扩增后冻存处理，得到稳定表达PD‑1的细胞株。