[发明专利]使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法

摘要

一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，属精子鉴定方法，将FITC粉末中加入DMSO配置FITC浓储液，将MITO粉末中加入DMSO配置MITO浓储液，HEPES、氯化镁、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、碳酸氢钠、丙酮酸钠、葡萄糖、乳酸钠、牛血清白蛋白和超纯水配置stainingtalp精子染色缓冲液，精子FITC染色、MITO染色，将用FITC染色后的精子与用MITO染色后的精子等量混合，FITC、MITO染色后和FITC染色与MITO染色后的精子等量混合后3h荧光检测。本发明的有益效果是：在不影响精子活力的条件下，只通过两种荧光染光可将形态相近的精子在一定时间内区分出来。

主权项

一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，其特征在于：它包括以下步骤：一、配制试剂：（1）配置FITC浓储液： 将FITC粉末中加入DMSO，使其终浓度为0.5M，分装后避光在‑20℃保存，使用期限为1年；（2）配置MITO浓储液： 将MITO粉末中加入DMSO,使其终浓度为0.069mM/L，分装后避光在‑20℃保存，使用期限为1年；     （3）配置staining talp精子染色缓冲液：                HEPES                   40mM/L                  氯化镁                   0.4mM/L                   氯化钠                   95mM/L                    氯化钾                   3mM/L                  磷酸氢二钠               0.3mM/L                  碳酸氢钠                 10mM/L                  丙酮酸钠                 2mM/L                葡萄糖                   5mM/L                  乳酸钠                  25mM/L                  牛血清白蛋白            3g/L                             超纯水                  其余为超纯水；     二、精子染色：（1）精子FITC染色：     ①取500万精子加入5ml的staining talp精子染色缓冲液，使精子终浓度为100万/ml；     ②在步骤①的精子溶液中加入0.75µl的FITC浓储液，使其终浓度为0.077mM/L，轻轻摇动将染色液摇匀；     ③在37℃避光染色40分，将染色的精子轻轻摇晃；     ④染色结束后，1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； ⑤1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动；     ⑥1500rpm离心10分，弃上清，加入250µl staining talp精子染色缓冲液；（2）精子MITO染色：①取500万精子加入5ml的staining talp精子染色缓冲液，使精子终浓度为100万/ml；②在步骤①的精子溶液中加入1.81µl的MITO浓储液，使其终浓度为3.45×10^‑5mM/L，轻轻摇动将液体摇匀；③在37℃避光染色10分；④染色结束后，1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动；⑤1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动；⑥1500rpm离心10分，弃上清，加入250µl staining talp精子染色缓冲液；（3）精子混合：将步骤（1）用FITC染色后的精子与步骤（2）用MITO染色后的精子等量混合，放在37℃，3h；（4）检测：①对步骤（1）用FITC染色后的精子、步骤（2）用MITO染色后的精子进行荧光检测；②对步骤（3）FITC染色后的精子与MITO染色后的精子等量混合后3h 的混合精子进行荧光检测 。