[发明专利]一种中药中赭曲霉毒素A的适体亲和柱净化新方法

摘要

本发明涉及一种以NHS活化的sephrose4FF为载体，赭曲霉毒素A特异性适体为配基制备的具有操作简单，偶联速度快，偶联效率高的适体亲和柱的制备方法。经系统考察后，该亲和柱在中药中适用性良好，能起到快速净化中药中赭曲霉毒素A的目的，且所建立的检测方法准确度好，灵敏度高，可用于中药中赭曲霉毒素A的快速筛查。此外，该适体亲和柱制备方法简便易行，生产成本较低，质量稳定可控，能满足中药中赭曲霉毒素A的快速检测，具有广阔的开发前景。

主权项

1.一种中药中赭曲霉毒素A的适体亲和柱净化方法，其特征在于：1)以NHS活 化的sepharose 4FF为载体，OTA适体特异性DNA配基为吸附剂制备适体亲和柱；OTA 适体亲和柱的制备步骤：a.OTA适体序列的筛选：合成相关适体DNA序列，考察不同序列对黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2及OTA的特异性，选定OTA特异性序列为5’‑GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGG‑AGCATCGGACA‑3’，选择合适的末端修饰方法‑5’端C6间隔臂氨基修饰；b.适体亲和柱的制备：其步骤主要包括适体复性，洗涤，偶联，封闭，洗涤，装柱；最佳的载体活化方式为NHS，偶联pH值6.0‑10.0，偶联时间0‑6h；c.最大吸附量：在最优偶联条件下，制备不同批次适体亲和柱，其最大吸附量高达188.96±10.56ng；2)以适体亲和柱为净化方法，结合UPLC‑FLR技术建立姜粉中OTA的检测方法；其中，样品提取与净化：称取姜粉20.0g，加入60mL体积比为60∶40的乙腈‑水溶液，超声提取15min，定量滤纸粗滤，取5mL滤液加45mL pH范围在5.0‑9.0之间的BBS2，浓度为0.5‑2.0倍的BBS1；其中BBS1：10mM Tris，120mM NaCl，5mM KCl，5mM MgCl2，pH7.5；BBS2：12.5mM Tris，150mM NaCl，6.25mM KCl，6.25mM MgCl2；混匀，玻璃纤维滤纸过滤，取AAC柱用1‑5mL BBS1活化，将稀释后的滤液移取3‑9mL过柱，用1‑5mL BBS1淋洗，直至空气完全过柱，加入0.5‑1.5mL纯甲醇洗脱，将洗脱液用氮气在45℃吹干，最后用体积比为50∶50甲醇‑水定容至0.5mL，振荡混匀后，12000rpm下离心5min，取上清液供UPLC测定；3)以适体亲和柱为净化方法，结合UFLC‑MS/MS技术建立中药中OTA的检测方法；其中，样品提取与净化：取药材粉末2.0g，加入体积比为60∶40，的乙腈‑水8mL，2400rpm下涡旋提取2min，静置30min，4000rpm下离心10min，取3mL滤液用BBS2稀释至30mL，混匀，调节pH至4.5‑8.5，玻璃纤维滤纸过滤，取AAC柱用3mL BBS1活化，将稀释后的滤液取2mL过柱，用1mL BBS1淋洗，加入1mL纯甲醇洗脱，洗脱液用氮气在45℃吹干，加入浓度为100ng/ml的内标工作液5μL，最后用体积比为50∶50的甲醇‑水定容至0.5mL，振荡混匀后，12000rpm下离心15min，取上清液供UFLC‑MS/MS测定。