[发明专利]与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建及应用

摘要

本发明提供一种与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建，将CYPA3A4的表达质粒pcDNA3.1-Hygro-CYP3A4转染MDCK-mock，MDCK-hOCT1细胞，经潮霉素及G418抗性筛选，获得具有稳定抗性的单克隆细胞，通过westernblot检测CYP3A4的蛋白表达，获得稳定单表达CYP3A4及稳定共表达CYP3A4，hOCT1的细胞，用经典底物及抑制剂进行功能验证。本发明建立的细胞模型可以用于细胞水平专属性研究CYP3A4的作用，及研究hOCT1及CYP3A4的共同作用，预测药物在肝脏的处置情况，预测可能由CYP3A4,hOCT1介导的药物相互作用。本发明设计合理，专属性和重复性好。

主权项

1.一种与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建，其特征在于，通过以下步骤实现：设计含有KpnⅠ，XhoⅠ两个酶切位点的引物，引物序列如SEQIDNo:1，2所示，将终止密码子之前带有组氨酸标签的人CYP3A4cDNA克隆于载体质粒pcDNA3.1(+)-Hygro上，构建表达质粒pcDNA3.1(+)-Hygro-CYP3A4，表达质粒转染MDCK-pcDNA3.1(+)及MDCK-hOCT1细胞，转染后通过氨基糖苷类抗生素G418及潮霉素B进行抗性筛选，挑选单克隆细胞，单克隆细胞进行westernblot验证CYP3A4的蛋白表达，得到稳定表达CYP3A4的MDCK-CYP3A4及MDCK-hOCT1-CYP3A4细胞，并通过Westernblot从中挑选出CYP3A4蛋白表达量一致的细胞，提取总RNA，通过引物序列如SEQIDNo:4-9所示的特定引物进行Real-timePCR验证细胞中CYP3A4及hOCT1的mRNA表达，并与空载体细胞及MDCK-hOCT1进行比较，进而以P450-GloCYP3A4Assay试剂盒检测CYP3A4活性，并考察酮康唑对代谢活性的影响，从而确认转染细胞CYP3A4的功能；应用hOCT1荧光底物4-(4-(dimethylami-no)styryl)-N-methylpyridinium，结合hOCT1抑制剂四乙胺验证细胞hOCT1的功能；其中人CYP3A4cDNA的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示。