[发明专利]一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法

摘要

本发明公开一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，包括制备载体、收集菌株、制备烟曲霉生物膜载体、阿利新蓝刚果红染色方法和菌株观察方法；将浓度为1~5×105·孢子·ml-1的烟曲霉放置于无菌玻璃细胞爬片，静置于35~37℃生化培养箱中培养，然后分别在培养的不同时间用阿利新蓝刚果红复合染色染胞外多糖，光镜下观察烟曲霉生物膜胞外多糖的变化。本发明提供的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法实验操作简单、快速准确得出结果和重复性好，适用于临床检验和实验室研究。

主权项

一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：包括制备载体、收集菌株、制备烟曲霉生物膜载体、阿利新蓝刚果红染色方法和菌株观察方法，具体检测步骤如下：1）制备载体 将直径为10~15 mm玻璃细胞爬片进行灭菌，作为载体；2）收集菌株 将烟曲霉经过96孔板造膜，以结晶紫半定量法筛选出成膜能力最强的菌株，作为试验菌株；3）制备烟曲霉生物膜载体 将步骤2）获得的菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于35~37℃培养箱培养活化3~5天，用5~10ml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~25ml MOPS缓冲的RPMI‑1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI‑1640液体培养液调整浓度为1~5×105·孢子·ml‑1，将1~2ml孢子悬液加入步骤1）制备的玻璃细胞爬片上，玻璃细胞爬片置于无菌24孔板的孔内，每孔放一个，静置于35~37℃生化培养箱中培养；4）阿利新蓝刚果红染色方法  A：制备阿利新蓝和刚果红染液，将2~5g阿利新蓝、97~100ml无菌双蒸水和3~5ml冰乙酸置于容器中，并不断搅拌至阿利新蓝颗粒完全溶解，得阿利新蓝染液；将1.5~3g刚果红和95~105ml无菌双蒸水置于容器中，并不断搅拌至刚果红颗粒完全溶解，得刚果红染液；B：用无菌磷酸盐缓冲液漂洗步骤3）制备的烟曲霉生物膜载体，去除浮游菌；C：将步骤A获得的15~20μl阿利新蓝染液滴加到步骤B漂洗干净的烟曲霉生物膜载体上，并晃动载体使染液均匀涂布，静置5~10min；D：将步骤C染色的烟曲霉生物膜载体用红外高温灭菌器加热，待染液干燥并固定；E：将步骤A获得的15~20μl刚果红染液滴加到步骤D固定的烟曲霉生物膜载体上，并晃动载体使染液均匀涂布，静置5~10min；F：将步骤E染色的烟曲霉生物膜载体在用红外高温灭菌器加热，待染液干燥并固定；G：将步骤F获得的载体用无菌磷酸盐缓冲液漂洗，洗掉未粘附的多余的染液，直至洗脱液无色为止；5）菌株观察方法将步骤3）制备的烟曲霉生物膜载体于8、12、16、20、24、48h取出，每次取2~10个，并按步骤4）进行染色，在普通光镜下放大200倍观察，观察菌株变化。