[发明专利]一种制备猪源干扰素-λ3的方法和应用

摘要

本发明公开了一种制备猪源干扰素-λ3（IFN-λ3）蛋白的方法和应用，属于基因工程产品制备领域。包括编码猪源干扰素-λ3基因的克隆，含不包括信号肽序列的猪源干扰素-λ3基因的原核表达载体的构建，用所述含猪源干扰素-λ3基因的重组原核表达载体转化大肠杆菌和诱导表达，最佳诱导温度、时间和IPTG浓度分别为诱导温度20℃，时间16h，IPTG浓度0.4mM。通过本方法制备的产品为研究猪源干扰素-λ3生物活性及其作用机理提供了基础，也可在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中应用。

主权项

一种在大肠杆菌中表达猪源IFN‑λ3基因的方法，其特征在于具体步骤如下：（1）用poly（I:C）诱导培养ST细胞，收获诱导培养的细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA；（2）设计扩增猪源IFN‑λ3基因全长的特异性上游引物S1和下游引物S2，以及扩增不含信号肽序列的猪源IFN‑λ3的特异性上游引物P1和下游引物P2，引物如下：上游引物S1：5’‑ATGGCCCTGGGTGGCTCG‑3’；下游引物S2：5’‑TCAGACACACAGGTCTCC‑3’；上游引物P1：5’‑CGGGTACCGTGCCTGTCCCTGAAGCCC‑3’；下游引物P2：5’‑CCGCTCGAGGACACACAGGTCTCCACT‑3’；（3）利用引物S1和S2通过RT‑PCR技术扩增猪源IFN‑λ3基因全长，；（4）将猪源IFN‑λ3基因克隆入pMD‑18T载体、进行测序鉴定，获得重组载体pMD‑18T‑IFN‑λ3；（5）以pMD‑18T‑IFN‑λ3克隆载体为模板，利用引物P1和P2扩增不含信号肽序列的猪源IFN‑λ3的基因，并利用KpnI和XhoI这两个多克隆位点，将猪源IFN‑λ3基因定向亚克隆至原核表达载体pET‑32a，获得重组表达质粒pET‑32a‑Po‑IFN‑λ3；（6）重组表达质粒pET‑32a‑Po‑IFN‑λ3转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS；（7）确定原核表达系统中表达猪源IFN‑λ3的最佳诱导温度、时间和IPTG浓度；（8）猪源IFN‑λ3在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中的诱导表达。