[发明专利]化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段及其表达、应用

摘要

本发明化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段及其表达、应用涉及基因工程技术和诊断试剂领域。本发明是通过计算机分析，筛选出肺炎链球菌PspA蛋白内的强抗原表位，第33个氨基酸至第109个氨基酸，共77个氨基酸，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技术，表达该基因片段、制备肺炎链球菌PspA蛋白强抗原表位片段。表达的蛋白可用于疫苗研发、肺炎链球菌感染抗体的检测及单抗和多抗的制备。

主权项

1.一种化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白的胞外区基因片段，该基因片段编码含强抗原表位肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段，即第33个氨基酸至第109个 氨基酸，共77个氨基酸，在该基因片段的5'端增加了BamHI酶切位点（下划线部分），在3'端增加了终止密码子TGA和EcoRI酶切位点（下划线部分），化学合成的基因序列全长246bp，序列如下：GGATCC GAA GCC CCG GTT GCC AGC CAA TCG AAG GCG GAA AAA GAC TAC GAC GCA GCC GTG AAG AAA AGC GAA GCA GCG AAA AAA GCA TAC GAA GAA GCA AAA AAG AAA GCG GAA GAT GCC CAG AAG AAA TAC GAT GAA GAC CAA AAG AAA ACC GAA GAA AAA GCG GAA AAC GAA AAG AAA GCG GCG GCA GAC CTG AAT GAA GCG ACC GAA GTC CAT CAA AAG GCG TAT GTG CGT TAC TAA CTCGAG权利要求1所述的化学合成的基因片段，采用基因工程技术表达该基因序列编码的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段，纯化表达的蛋白片段，具体方法如下：表达肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段重组质粒的构建:用 Bam HI和EcoR I双酶切质粒pGEX4T-2和化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段，电泳回收后，用T4 DNA 连接酶连接，使肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段插入到载体pGEX4T-2内的BamH I和EcoR I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白，全长303个氨基酸,该融合蛋白N端融合了载体上的226个氨基酸，C端包含肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段，电泳回收后，用T4 DNA 连接酶连接，使肺炎链球菌PspA蛋白内的第33个氨基酸至第109个氨基酸链接到载体质粒，全长氨基酸序列如下：表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定:　　将重组质粒转化E. coli BL21(DE3)，涂布含100μg／ml氨苄青霉素的LB平板，置37℃ 过夜，次日随机挑取转化菌落和含质粒pGEX4T-2的对照菌，提取质粒 ，用限制性内切酶BamHI和XhoI对质粒双酶切，1.0％的Agarose凝胶检测双酶切产物应切下约220bp的基因片段。