[发明专利]高效包装与表达黑色素瘤分化相关基因-7的腺病毒构建方法

摘要

本发明提供一种高效包装与表达黑色素瘤分化相关基因-7的腺病毒构建方法，本发明采用属于腺病毒AdMax^TM的pDC316为载体，以此构建重组腺病毒表达载体代替最普及的AdEasy系统。与目前使用最普及的腺病毒AdEasy系统相比，腺病毒AdMax^TM系统具有操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高（一般大于10⁴vp/cell）的特点。本发明以选择性诱导肿瘤细胞凋亡的黑色素瘤分化相关基因7（mda-7）为治疗基因，通过AdMax^TM系统包装mda-7基因构建了复制缺陷型腺病毒载体Ad.mda-7.egfp，并证明其具有选择性诱导肺腺癌细胞株A549凋亡的功能，为肺腺癌的基因治疗奠定了良好的实验基础。

主权项

一种高效包装与表达黑色素瘤分化相关基因‑7的腺病毒构建方法，其特征在于：本发明主要分为两个步骤，步骤一为腺病毒表达载体的构建，即采用AdMax腺病毒包装系统构建表达黑色素瘤分化相关基因－7（melanoma differentiation‑associated gene 7 ，mda－7）的腺病毒表达载体Ad.mda‑7.egfp，以此构建重组腺病毒表达载体代替最普及的AdEasy 系统，提高腺病毒出毒成功率；其主要方法为：将重组的含有目的基因mda‑7片段的穿梭质粒载体pDC316‑ mda‑7和骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre，共同转染至HEK293细胞，包装产生重组腺病毒Ad.mda‑7.egfp，并进行扩增及感染性滴度测定，步骤一主要为保证AdMax系统出毒成功率，即保证AdMax系统真核细胞内重组出毒，出毒成功率大于98%；步骤二为腺病毒表达载体的功能鉴定，即以Ad.egfp，Ad.mda‑7.gfp为对照病毒，以支气管上皮细胞HBE为对照细胞，观察Ad.mda‑7.egfp表达绿色荧光蛋白的效率及选择性诱导肺腺癌细胞A549调亡的效应；其主要方法为：（1）以Ad.mda‑7.gfp为对照病毒，流式细胞仪检测Ad.mda‑7.egfp及Ad.mda‑7.gfp表达绿色荧光蛋白的效率；（2）以Ad.egfp为对照病毒， PI染色法检测Ad.mda‑7.egfp诱导A549细胞凋亡的效应；（3）以支气管上皮细胞HBE为对照细胞，流式细胞仪检测Ad.mda‑7.egfp选择性诱导肿瘤细胞凋亡。