[发明专利]细胞DNA损伤检测方法

摘要

细胞DNA损伤检测方法，涉及细胞损伤检测。将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热，取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中，使胶平展铺开冷却固化，再将板盖浸入细胞裂解液中裂解；用碱性解旋液冲洗裂解后的胶板，然后将胶板浸入装有预冷碱性解旋液的容器中；将碱解旋后的胶板置于装有预冷电泳液的电泳槽中电泳；将电泳后的胶板在Milli‑Q水中浸泡；将胶板用预冷无水乙醇静置浸泡后，取出胶板，将胶板冷藏保存；在脱水干燥后的胶板上每孔滴加一滴Milli‑Q水，静置，润湿胶板后每孔滴加10～15μL的溴化乙啶，避光染色，用滤纸吸干胶板表面残余的染液，即可在515nm激发波长下进行图像采集。

主权项

细胞DNA损伤检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)凝胶板的制备：将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热，取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中，使胶平展铺开，冷却固化；所述将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热的方法为：将24孔细胞培养板板盖绞掉一组对应的横或者竖的外围，另一组保留，再将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热；所述预热的温度为37℃；所述取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中是取50～80μL混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中；所述使胶平展铺开采用枪头辅助推胶使胶平展铺开；所述冷却的条件为4℃下冷却3～5min；所述低熔点琼脂糖凝胶的质量分数为0.4％～0.6％，所述待测样品细胞密度为(8～10)×105个/mL，细胞悬液与低熔点琼脂糖凝胶的体积比为1∶3～5；2)细胞裂解：将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入细胞裂解液中裂解；所述将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入细胞裂解液中裂解是将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入4℃的细胞裂解液中避光裂解1.5～2h；所述细胞裂解液的组成为100mmol/LNa2EDTA、2.5mol/L NaCl、10mmol/L Tris‑HCl缓冲液，pH＝10；临用前加Triton X‑100至体积分数1％，同时加DMSO至体积分数10％；3)DNA碱解旋：用碱性解旋液冲洗裂解后的胶板，然后将胶板浸入装有预冷碱性解旋液的容器中，静置；所述解旋液的组成为1mmol/L Na2EDTA，300mmol/L NaOH，pH>13；4)电泳：将碱解旋后的胶板先用电泳液冲洗，然后置于装有预冷电泳液的电泳槽中进行电泳；所述电泳液为TAE，50×TAE配制方法为242g Tris‑base、37.2g Na2EDTA·2H2O，加入57.1mL的冰乙酸充分溶解，用NaOH溶液调节pH值为8.3，Milli‑Q水定容至1L，室温保存，使用前将其稀释50倍并置于4℃冷藏2h以上；5)中和：将电泳后的胶板在Milli‑Q水中浸泡；6)脱水与晾干：用滤纸吸去中和后胶板表面的残留水，将胶板用预冷无水乙醇静置浸泡后，取出胶板，重复脱水一次，将自然晾干之后的胶板冷藏保存；7)染色以及图像采集：在脱水干燥后的胶板上每孔用胶头滴管滴加一滴Milli‑Q水，静置，润湿胶板后每孔滴加10～15μL的溴化乙啶，避光染色，用滤纸吸干胶板表面残余的染液，即在515nm激发波长下进行图像采集。