[发明专利]一种烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法

摘要

本发明公开了一种烟草花叶型病株中烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草脉带花叶病毒3种病毒的检测方法。通过烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草脉带花叶病毒特异性混合抗体诱捕病样中病毒，不必提取样品总RNA进行随机引物逆转录和特异性病毒引物复合PCR反应，专门针对烟草生产过程对烟草中上部叶片为害较为严重且不能从症状区分病原而建立的一种单管同时检测3种病毒中的1、2或3种不同病毒组合的方法，检测时间仅需5小时。本方法将快速、特异的免疫沉淀与灵敏的复合RT-PCR结合，同时设置健康烟草随机引物cDNA产物和相应病毒PCR特异片段阳性质粒作为阴、阳性对照，从而快速、准确、灵敏的检测田间烟草植株样品、抗病毒材料及田间环境疑似侵染源等。

主权项

一种烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于包括前处理、PCR反应、电泳检测步骤，具体包括：A、前处理：待测样品与DEPC处理的PBST溶液混合后进行研磨，离心后取上清液备用；根据GenBank序列数据库中烟草花叶病毒序列，选择单一病毒中较为保守的区域设计引物，不同病毒间试验优化不同引物对间的影响筛选用于复合PCR的不同病毒检测引物对，在PCR管中加入用DEPC溶液稀释的病毒特异性抗体，混合抗体包被于无RNA酶及DNA酶的PCR管备用；取上清液50μl加入PCR管中，36~38℃放置0.5~1.5h以捕捉或沉淀对应的病毒粒子，吸出PCR管中液体，用经DEPC处理的PBST溶液洗涤PCR管内壁2~4次，吸出PCR管中液体，再用DEPC处理水洗涤1~2次PCR管内壁，吸出PCR管中液体，离心，吸净PCR管中液体，PCR管3~5℃放置待用；B、PCR反应：在PCR管中以病毒RNA作为模板，利用9个单核苷酸碱基的随机引物进行逆转录反应，合成cDNA链，应用烟草花叶病毒引物对进行复合PCR反应；C、电泳检测：取反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测。