[发明专利]一种从胎盘中灌洗造血干细胞的方法

摘要

本发明提供了一种从胎盘中灌洗造血干细胞的方法，所述方法包括胎盘的收集、胎盘的初检、胎盘的预消毒、胎盘及母血检测、胎盘造血干细胞的灌洗、造血干细胞的浓缩纯化六个步骤，所述方法和使用的设备简单，操作方便，洗脱出来的造血干细胞损伤小，数量多，浓度高，活性强，可以应用于自体或者异体的造血干细胞的移植，并且有助于受损组织的修复。

主权项

一种从胎盘中灌洗造血干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括胎盘的收集、胎盘的初检、胎盘的预消毒、胎盘及母血检测、胎盘造血干细胞的灌洗、造血干细胞的浓缩纯化的步骤，其分别为：（1）胎盘的收集：在手术室无菌环境下收集胎盘及母血，存放于无菌的胎盘储运盒中，贴好标签、条码，胎盘储运盒的温度保持在4‑10 ℃，24小时内送达实验室；（2）胎盘的初检：检查胎盘储运盒盒内温度、标签、送达日期、储运盒是否有渗漏、是否有母血血样；（3）胎盘的预消毒：将胎盘的胎儿面展开放置于胎盘冲洗盒的底部，用生理盐水冲洗胎盘表面，打开胎盘冲洗盒底面的排水孔，去掉冲洗的生理盐水，检查胎盘表面钙化情况；（4）胎盘及母血检测：对所取的胎盘和母血样本进行检测，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型（HLA）检测、造血干/祖细胞定性检测（CFU‑GM）；（5）胎盘造血干细胞的灌洗：将胎盘在无菌条件下用无菌生理盐水清洗掉胎盘上的血凝块及积血，采用消毒剂消毒后，将灌注液针头插入胎盘脐动脉中，胎盘灌注回收瓶针头插入脐静脉中，止血钳夹紧，缓慢开启恒流泵，灌注液经胶管、开关、蠕动泵、针头、胎盘动脉、胎盘、胎盘静脉、胎盘灌注回收瓶针头，最后在灌洗液回收瓶中接收灌洗液；（6）造血干细胞的浓缩纯化：将灌洗出来的灌洗液，在离心机中以1500‑2000 rpm离心15‑20分钟，去掉上清液，收集沉淀和下层的液体，将收集到的沉淀和下层的液体与生理盐水按2：1‑1：2的比例混匀得混合液，然后将混合液和淋巴细胞分离液按2：1‑1：2的比例分别加入到离心管中，添加的顺序为先在离心管中加入淋巴细胞分离液，再缓慢加入混合液，加入过程中注意保持淋巴细胞分离液的液面平整，加完后以2200‑2500 rpm离心20‑25分钟，离心时慢加速慢减速，离心结束后，收集中间白膜层到新的离心管中，以2：1‑1：2的比例加生理盐水混匀，1200‑1500 rpm离心10‑15分钟；离心结束后去掉上清液，加入10‑20 mL生理盐水吹打沉淀，再1200‑1500 rpm离心10‑15分钟，离心结束后，去掉上清液，用DMEM培养基重悬沉淀，收集造血干细胞群，将重悬的细胞群进行细胞和霉菌培养，造血干细胞定量检测（CD34），造血干细胞活性检测（台盼蓝染色），造血干细胞定性检测（CFU‑GM）。