[发明专利]一种牡丹SINE类转录转座子序列的分离方法

摘要

一种牡丹SINE类反转录转座子序列的分离方法，先分离出牡丹SINE类反转录转座子的部分序列，根据其序列设计引物；以所设计引物进行PCR反应，得到生物素标记的探针；提取牡丹基因组后进行酶切，得到基因组酶切片段；同时将两条寡聚核苷酸链退火，形成双链的寡聚核苷酸接头，之后将酶切后的基因组片段与接头连接，并以单引物的PCR扩增，进行基因组片段库的富集；将生物素标记的探针与所得基因组片段杂交，筛选出目的片段；所得目的片段进行接头PCR，将反应产物进行克隆及阳性菌筛选以后，测序，进行序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子序列。本发明提供的分离牡丹SINE类反转录转座子序列的方法，为开发基于牡丹SINE类反转录转座子的分子标记提供基础。

主权项

一种牡丹SINE类反转录转座子序列的分离方法，其特征在于，具体操作步骤为：步骤一、牡丹SINE类反转录转座子的部分序列的分离：根据真核生物SINE类反转录转座子的保守序列Box A和Box B区域，以两个单引物分别进行PCR扩增，将两次PCR扩增出的产物，进行克隆及阳性菌筛选以后，测序，进行序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子的部分序列；所用的两个单引物序列为：引物A  5'‑TGGCCTAGTGG‑3'；引物B  5'‑GAGGAYTTG AACC‑3'；步骤二、生物素标记的探针的制备：根据步骤一中所得到的牡丹SINE类反转录转座子的部分序列设计5’端生物素标记的探针引物，以质粒DNA为模板进行PCR，得到生物素标记的探针；所设计的生物素标记的探针引物的序列为：PTSB01 5'‑TAGTGGTGTCTAAGGATTTTGTGAG‑3'；PTSB02 5'‑AATCCTGTTCAGCATTCCCGTA‑3'；其中PTSB01进行5’端生物素标记；步骤三、基因组片段富集库的制备：提取牡丹基因组DNA，然后以限制性内切酶Bsp143I进行基因组酶切，得到基因组酶切片段；同时将两条寡聚核苷酸链退火，形成双链的寡聚核苷酸接头，之后通过T4连接酶将酶切后的基因组片段与接头连接，并以单引物的PCR扩增，进行基因组片段库的富集，得基因组片段，备用；形成双链的寡聚核苷酸接头的两条寡聚核苷酸链分别为：Adaptor 1       5'‑GTAATACGACTCACTATAGGGCCGAGGT‑3'；Adaptor 2        3'‑CCCGGCTCCACTAG‑5'；单引物的PCR扩增进行基因组片段库的富集，所用引物为：Adapcr     5'‑GTAATACGACTCACTATAGGGC‑3'；步骤四、目的片段的筛选、扩增与测序：将生物素标记的探针与步骤三中所得基因组片段杂交，通过MagneSphere磁珠筛选出目的片段；将筛选出的片段进行接头PCR，将反应产物进行克隆及阳性菌筛选以后，进行测序和序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子序列。