[发明专利]一种牡丹基因组DNA分子标记方法

摘要

一种牡丹基因组DNA分子标记方法，提取牡丹基因组DNA进行酶切，将酶切产物和接头DNA连接；将连接产物与预扩增引物进行PCR扩增，得到预扩增产物；取所得到预扩增产物与用内切酶接头选择性扩增引物iPBS引物进行PCR扩增，得PCR选择性扩增产物；然后取PCR选择性扩增产物，加入染色液并点样进行电泳，电泳完成后，银染，观察、拍照，分析结果。本发明是建立在PCR与酶切基础上的分子标记技术，操作简单；成本低，适用性强；针对牡丹基因组研究技术而设计，开发了一种新的基于反转录转座子的分子标记体系，为牡丹的种质资源遗传变异和进化研究提供新的技术手段。

主权项

一种牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于：其具体操作步骤为：步骤一、提取牡丹基因组DNA；步骤二、牡丹基因组DNA的酶切：用限制性内切酶Mse I和限制性内切酶EcoR I对上述步骤一所提取的基因组DNA进行酶切，得到基因组DNA酶切产物；步骤三、酶切产物和接头DNA连接：将所得基因组DNA酶切产物、Mse I接头引物、EcoR I接头引物、T4 DNA连接酶和稀释10倍后的连接缓冲液混合均匀后在温度为16℃的条件下保温30min，得到连接产物；所述的Mse I接头引物序列包括Mse I 5'端接头引物和Mse I 3'端接头引物，其碱基序列如序列表序列1和序列2；所述的EcoR I接头引物序列包括EcoR I 5'端接头引物和EcoR I 3'端接头引物，其碱基序列如序列表序列3和序列4；步骤四、连接产物的预扩增：（1）、取上述步骤三所得部分连接产物，将其与用双蒸水稀释10倍后的Buffer、含Mg²⁺的溶液、dNTPs、用双蒸水稀释至20μmol/L的Mse I预扩增引物、Taq酶和双蒸水混合后，进行PCR扩增，得到Mse I预扩增产物；（2）、取上述步骤三所得剩余连接产物，将其与用双蒸水稀释10倍后的Buffer、含Mg²⁺的溶液、dNTPs、用双蒸水稀释至20μmol/L的EcoR I预扩增引物、Taq酶和双蒸水混合后，进行PCR扩增，得到EcoR I预扩增产物；所述的Mse I预扩增引物，其碱基序列如序列表序列5；所述EcoR I预扩增引物，其碱基序列如序列表序列6；步骤五、选择性扩增：取上述步骤四得到的Mse I预扩增产物和EcoR I预扩增产物，分别用双蒸水稀释20‑40倍后，将其与用双蒸水稀释至20μmol/L的内切酶接头选择性扩增引物、用双蒸水稀释至20μmol/L的iPBS引物、Taq酶、dNTPs、稀释10倍后的缓冲液和双蒸水混合均匀后，进行PCR扩增，得PCR选择性扩增产物；所述内切酶接头选择性扩增引物为碱基序列如序列表序列7、序列8和序列9的Mse I选择性扩增引物中的任意一条，或者碱基序列如序列表序列10和序列11的EcoR I选择性扩增引物中的任意一条；所述的iPBS引物为碱基序列如基因序列表序列12至序列52中引物的任意一条；步骤六、将所得PCR选择性扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳观察结果。