[发明专利]烟草鲨烯环氧酶蛋白、烟草鲨烯环氧酶基因及其应用有效
申请号: | 201410062817.1 | 申请日: | 2014-02-24 |
公开(公告)号: | CN103805576B | 公开(公告)日: | 2017-04-19 |
发明(设计)人: | 陈千思;周会娜;刘萍萍;王燃;翟妞;金立锋;魏春阳;陈霞;李锋;杨军;林福呈;郑庆霞 | 申请(专利权)人: | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 |
主分类号: | C12N9/02 | 分类号: | C12N9/02;C12N15/53;C12N15/82;A01H5/00 |
代理公司: | 郑州优盾知识产权代理有限公司41125 | 代理人: | 郑园,张真真 |
地址: | 450001 河南省*** | 国省代码: | 河南;41 |
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摘要: | 本发明公开了一种烟草鲨烯环氧酶蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。烟草鲨烯环氧酶基因NtSE是烟草甾醇合成途径的关键调控基因。在幼嫩组织中特异高表达,将构建好的病毒介导的基因沉默载体TRV‑NtSE接种本氏烟草,并得到高沉默效率的植株,检测本氏烟草中植物甾醇的含量,发现基因沉默植株中甾醇含量显著下降,下降了21.37%,表明沉默该基因可以显著的降低植物的甾醇含量。烟草鲨烯环氧酶基因NtSE是烟草甾醇合成途径的关键调控基因,可用于调节烟草的甾醇含量,有助于低甾醇优质烟草的基因工程育种。 | ||
搜索关键词: | 烟草 鲨烯环氧酶 蛋白 基因 及其 应用 | ||
【主权项】:
利用烟草鲨烯环氧酶基因培育甾醇含量减低的转基因烟草的方法,其特征在于,通过构建载有烟草鲨烯环氧酶基因的病毒诱导沉默载体或RNAi干涉载体,并转化烟草,获得甾醇含量减低的转基因烟草;所述烟草鲨烯环氧酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示,具体包括以下步骤:(1)设计引物序列如下:NT‑SS‑F,5ˊ‑ATGGTACCGATGTACTGGTCAAAAAGTGCCT‑3ˊ,NT‑SS‑R,5ˊ‑CACTCGAGTCAGCCGGGCTCCAATCCAC‑3ˊ;PCR扩增烟草鲨烯环氧酶基因中第629位至第1127位核苷酸序列,共499bp片段,(2)将步骤(1)中扩增片段插入VIGS载体中,构建TRV‑NtSE载体;(3)烟草种子播种于育苗钵中育苗,待发芽后两周进行分苗,种于塑料钵中,于22℃,16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理;(4)生长4‑5w,选取长势一致将含有TRV1、TRV2、TRV2‑SS农杆菌单菌落接入YEB培养基中,1L YEB培养基组成为5g牛肉浸膏、5g细菌蛋白胨、5g蔗糖、1g酵母抽提物、2ml 1M硫酸镁,高温高压灭菌,28℃、250r/min过夜振荡培养至OD为1.0;(5)测OD值,计算亚培养需要的菌液体积X值,并吸取X体积的菌液接入50ml YEB中,内含10mmol/L 2‑N‑吗琳基乙磺酸和20μl/L乙酰丁香酮,即在50ml YEB加入5ml乙酰丁香酮,500ml 2‑N‑吗琳基乙磺酸,50ml抗生素,28℃过夜振荡培养至OD为0.2‑2.0;(6)测OD值,计算加入的MMA的量Y值,MMA为10mmol/L MgCl2,10mmol/L 2‑N‑吗琳基乙磺酸和100mmol/L乙酰丁香酮,调整悬浮液的浓度OD600=2.0,4000r/min离心8min收集农杆菌到50ml离心管中,倒出上清,向各菌体中加入MMA,再在TRV2、TRV2‑SS MMA悬浮液中等体积加入TRV1的MMA悬浮液混匀,室温静止1h后即可接种,挑选长势一致,4‑5片叶子的烟草植株,用1ml无针头无菌注射器通过压滤法把含有不同TRV重组质粒的农杆菌悬浮液从叶片背面压入全部展开的叶片中,使菌液充满整个叶片,于22℃,75%空气湿度中培养。
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