[发明专利]一种黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶在毕赤酵母的表达方法及其应用

摘要

本发明公开了一种毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法，它采用基因重组技术将黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因克隆到表达载体上，构建成表达重组质粒，并转化进入毕赤酵母，组建成表达工程菌，经发酵和表达上清浓缩，获得由毕赤酵母表达的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液，该粗酶液对鱼类革兰氏阳性病原菌(无乳链球菌)和革兰氏阴性病原菌(温和气单胞杆菌)具有抑菌作用，可用于后续抗菌制剂的开发。

主权项

一种利用毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L‑氨基酸氧化酶的方法，其特征在于工艺步骤为：(1)根据黄斑蓝子鱼L‑氨基酸氧化酶基因的ORF核苷酸序列和表达载体pPICZαA的核苷酸序列设计引物；(2)通过PCR技术获得带有限制性酶切位点和切除信号肽的黄斑蓝子鱼L‑氨基酸氧化酶基因的核苷酸序列；(3)将上述获得的黄斑蓝子鱼L‑氨基酸氧化酶基因的核苷酸序列克隆到pMD18‑T载体上，进行DNA序列测定，然后从pMD18‑T载体上切下，克隆到表达载体pPICZαA上，建成表达重组质粒pPICZαA‑LAAO；(4)将构建重组质粒pPICZαA‑LAAO，经过Sal I酶切线性化，电转化至Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，将菌液涂布到含有300μg/mLZeocin的YPDS平板上，28℃倒置培养2‑3d，获得重组转化子；(5)提取转化子基因组，通过特异PCR的方法鉴定获得已经正确插入目的基因的重组子；(6)接种鉴定验证正确的重组转化子于25mL BMGY(pH6.0)培养基中，28℃，250r/min培养48h，至OD600为2‑6，于室温离心2000r/min，5min，收集菌体；将菌体转移至200mL BMMY培养基中，28℃，250r/min培养，每隔24h补加一次为培养基体积0.5％的甲醇，诱导表达24‑96h；(7)所得上清液即为表达的黄斑蓝子鱼L‑氨基酸氧化酶粗酶液。