[发明专利]一种多基因共转化毕赤酵母的新方法

摘要

本发明公开了一种多基因共转化毕赤酵母的新方法。利用本方法，可以实现多个需要表达的外源基因连接到同一毕赤酵母表达载体，在该表达载体中，每个基因都位于彼此独立的表达框内；用构建的共表达载体转化毕赤酵母，可以实现多个基因高效且同时稳定整合到毕赤酵母基因组中。该方法为实现多个基因同时在同一毕赤酵母细胞中独立表达提供了有效的新方法。

主权项

1.一种多基因共转化毕赤酵母的新方法，其特征在于，利用该方法可以实现2个及以上基因共转化毕赤酵母（以共转2个基因为例），主要包括以下步骤：PCR分别扩增多个需要在转化到毕赤酵母中的目标基因（命名为A基因、B基因、C基因、D基因……，等等），分别构建目标基因的酵母表达载体（以酵母分泌表达载体pPICZα为例）pPICZα-A、pPICZα-B、pPICZα-C pPICZα-D……，等等；本发明以共表达两个基因（A基因和B基因，本发明中A、B基因分别以常用的绿色荧光蛋白基因eGFP和红色荧光蛋白基因Cherry为代表）为例进行说明；Bgl II-BamH I双酶切表达载体pPICZα-A，得到A基因酵母的独立表达框“Box-A”；BamH I单酶切pPICZα-B，将“Box-A”和酶切后的pPICZα-B进行连接，得到同时含有A基因及B基因的酵母表达载体载体pPICZαA/B；以此类推，若要实现A、B、C三个基因的表达，可将pPICZαA/B BamH I单酶切与利用Bgl II-BamH I双酶切表达载体pPICZα-C所得独立表达框“Box-C”进行连接，得到可独立表达的共表达载体pPICZαA/B/C，以此类推，可以构建更多基因独立表达的多基因共表达载体（本发明以共表达两个基因A、B为例进行说明）；酵母共表达载体载体pPICZαA/B电转化毕赤酵母，涂布YPDZ抗性平板，转化子长出后，利用A基因及B基因的引物PCR法对转化子进行验证，检测A和B基因插入到酵母基因组中的情况，挑选出既能扩增出A基因又能扩增出Ｂ基因的转化子即为共表达A、B基因的酵母转化子。