[发明专利]一种寡核苷酸和可消除质粒共转化用于大肠杆菌必需基因点突变的方法

摘要

本发明涉及一种利用寡核苷酸和可消除的质粒共转化对大肠杆菌基因组上的必需基因进行点突变的方法。具体为将前面四个碱基以硫磷酰基连接的、长度为91个碱基、中间为突变位点的寡核苷酸和可消除的质粒共转化表达重组酶的大肠杆菌。可消除的质粒含50bp与lacZ基因的同源序列、氨苄青霉素抗性基因、I-SceI基因、两个I-SceI酶切位点和R6K复制子。在由重组酶催化而与基因组50bp lacZ同源片段整合而表现氨苄青霉素抗性的菌株中，筛选点突变的菌株。整合型菌株可通过热失活的氯四环素作用，诱导表达I-SceI，I-SceI作用于其酶切位点，通过两个50bp lacZ片段之间的同源重组而去除可消除的质粒。

主权项

一种利用寡核苷酸和可消除的质粒共转化用于对大肠杆菌基因组上的必需基因进行点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：将寡核苷酸和可消除的质粒pLS1755共转化至表达重组酶的大肠杆菌;筛选氨苄青霉素抗性菌株，再从氨苄青霉素抗性菌株中筛选寡核苷酸发生重组而实现的点突变菌株；然后将再消除点突变菌株中的质粒pLS1755；所述寡核苷酸长度为91个碱基，第46个碱基为突变位点，寡核苷酸的前面四个碱基以硫磷酰基连接；所述质粒pLS1755通过以下构建得到：以pST98‑AS为模板，正向引物含酶切位点、50bp LacZ片段和18个碱基的I‑SceI酶切位点，反向引物含酶切位点和18个碱基的I‑SceI酶切位点，PCR扩增得到tetR‑ptetA‑I‑SceI的片段，酶切后克隆至R6K复制子和氨苄青霉素抗性基因的载体。