[发明专利]一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法

摘要

本发明涉及一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，利用Paraflim膜，采取膜夹营养法提取绿盲蝽唾液酶，并测定绿盲蝽中蛋白酶与纤维素酶的活性，Paraflim膜法提取绿盲蝽唾液酶利用Paraflim膜、胶卷盒、纱布、橡皮筋、位于两层Paraflim膜间的液体营养介质，利用酶与底物反应的原理，测定绿盲蝽唾液中蛋白酶、纤维素酶的活性。本方法材料易得，操作简单方便，制作成本低，占空间小，可实现绿盲蝽唾液酶的大量、批量提取，并且绿盲蝽可继续回收利用。

主权项

一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，其特征在于，具体过程为：步骤a，提取绿盲蝽唾液酶；取3龄绿盲蝽10头，饥饿6h后，置于两端开口的胶卷盒内，顶端覆以两层Paraflim膜，并在两膜间的间隙内用移液枪加入100μL液体营养介质，底端覆以纱布保持通气，重复10次；将装置放入光照培养箱中，待绿盲蝽刺吸取食6h后，移走绿盲蝽，用移液枪收集其唾液混合物，放入1.5mL离心管中；于4℃下，16000r/min离心30min，取上清，‑20℃冰箱中备用；步骤b，蛋白酶活性测定；步骤b1，制作标准曲线；首先配制浓度为1mg/mL的酪氨酸标准溶液，测定时以蒸馏水稀释至10、20、40、80、160、320和640μg/mL；取8支1.5mL离心管编号，①管加50μL水，其余每管依次分别加入50μL浓度为10、20、40、80、160、320和640μg/mL的酪氨酸溶液；每管再各加入140μL 0.55mol/L的碳酸钠溶液和20μL的Folin酚溶液，40℃下反应15min，利用分光光度计测定680nm处的OD值；步骤b2，活性测定；取20μL待测酶混合液于1.5mL的离心管中，加入0.5％酪蛋白50μL，40℃下反应15min，再加入10％三氯乙酸50μL于离心机在1000rpm，4℃条件下离心20min，对照组加入20μL不含酶的营养液，重复10次；取上清50μL加入20μL Folin酚和140μL 0.55mol/L的碳酸钠溶液，40℃下反应15min，于分光光度计680nm处测两组的OD值；步骤c，纤维素酶活性测定；步骤c1，标准曲线制作；葡萄糖溶液：用蒸馏水溶解27mg葡萄糖定容到25mL，取10支1mL的离心管编号，并按下表1所示加入各种试剂，于分光光度计490nm处测定其OD值；表1步骤c2，活性测定；取50μL待测酶混合液于1.5mL离心管中，加入200μL0.625％的羧甲基纤维素钠溶液，再加入50μL NaOH和100μL显色剂DNS，其中NaOH的浓度为2mol/L，显色剂DNS的浓度为3g/L，以不含酶营养液为对照组调零，重复10次，利用分光光度计测定490nm处的OD值。