[发明专利]一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其应用

摘要

本发明涉及一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程苗及其应用；是利用β毒素特异性引物,复活C型产气荚膜梭菌菌种，PCR扩增获得β毒素基因片段（930bp）连接到PET-28a（+）质粒上，然后将重组质粒导入受体菌株，成功构建重组菌株BL21(DE3)-β；重组的菌株BL21(DE3)以包涵体的形式高效表达β毒素；将β毒素蛋白与白油佐剂以体积比为1:1的比例进行乳化，加入0.01%的硫柳汞制得疫苗。该疫苗用于免疫妊娠后期的母畜，新生仔畜通过初乳获得被动免疫，能有效预防幼畜出血性坏死性肠炎(羔羊痢疾、犊牛肠毒血症、仔猪红痢等)；通过进行免疫保护效力实验证明该疫苗对兔的保护力达到了100%。

主权项

一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于是将β毒素蛋白与白油佐剂以体积比为1：1的比例进行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞制得；所述的β毒素蛋白的制备方法包括以下步骤：1）菌种复活及模板制备用接种环挑取C型产气荚膜梭菌菌种接种于一个血平板培养基上，40℃厌氧（88％N₂、7％H₂、5％CO₂）培养36h；取单个菌落接种于一个含7‑8毫升硫乙醇酸盐流体培养基（FT）的试管内，37℃厌氧培养12h，取1～5ml的培养液按照DNA提取试剂盒说明提取DNA，作为扩增目的基因的模板；2）β毒素基因的克隆根据GenBank中β毒素的基因序列设计引物进行PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；Primer1:GGAATTCAATGATATAGGTAAAACTAC;Primer2:CCTCGAGTTAAATAGCTGTTACTTTGTGAGT3）构建原核表达载体pET28a‑β将目的基因PCR产物和表达载体pET28a均使用Eco RI和Xho I酶切；将酶切后分别回收的目的基因PCR产物和表达载体pET28a进行纯化；将纯化的目的基因PCR产物和载体pET28a进行连接，得到重组质粒pET28a‑β；将pET28a‑β与BL21(DE3)感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)‑β；4）β毒素基因的原核表达、蛋白纯化用0.6mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达12h，经纯化得到β毒素蛋白。