[发明专利]一种基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解产物检测方法

摘要

本发明公开了一种基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解产物检测方法，包括步骤为：将低分子量肝素降解得到完全酶解产物，经过离子对反相色谱进行分离，再进行柱后荧光衍生反应，随之进行荧光检测，分析得到完全酶解产物的组成。通过上述方式，本发明采用离子对反向色谱与柱后荧光衍生联用的方法，既为无紫外吸收的低分子量肝素提供可检测的荧光基团，又可以实现高灵敏度的荧光检测，对低分子量肝素仿制药的研发、生产控制和保障药品安全具有极大的实用价值。

主权项

一种基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解产物检测方法， 其特征在于， 步骤为：将低分子量肝素降解得到完全酶解产物 ； 将所述完全酶解产物经过离子对反相色谱进行分离， 再进行柱后荧光衍生反应， 最后进行荧光检测， 分析完全酶解产物组成，其中所述离子对反相色谱法的过程为在流速为 1mL/min 下用第一流动相和第二流动相洗脱，在流速为0.1～0.8mL/min下用第三流动相和第四流动相进行柱后荧光衍生反应，所述降解过程为用肝素酶 I、II 和III在20～30℃下降解46～50 h， 降解产物经超滤膜过滤后真空减压干燥得到完全酶解产物；反相色谱条件包括采用填料粒径为5μm、色谱柱内径为4.6mm、色谱柱长度为250mm的Supelco Discovery C18反相色谱柱，在流速为1mL/min，洗脱梯度为0‑30min，100‑20%第一流动相，0‑80%第二流动相；30‑60 min，20‑0%第一流动相，80‑100%第二流动相；所述第一流动相的配制过程为将烷基铵类试剂和氯化钠溶于乙腈或甲醇中得到烷基铵类试剂浓度为2～10mM、 氯化钠浓度为0.1 ～ 0.5M的第一流动相， 所述第一流动相的 pH 值为 5.0 ～ 6.5； 所述第二流动相的配制过程为将烷基铵类试剂和氯化钠溶于乙腈或甲醇中得到烷基铵类试剂浓度为2～10mM、 氯化钠浓度为0.4 ～ 1.5M的第二流动相， 所述第二流动相的 pH 值为 5.0 ～ 6.5。