[发明专利]基于适体技术金纳米化学发光放大检测腺苷的方法

摘要

本发明公开了一种基于核酸适体技术的金纳米标记化学发光检测腺苷并在此基础上发展羟胺放大检测的方法，它是利用羧基修饰的磁性微球作为分离载体,通过氨羧反应将腺苷适体连接于磁性微球，通过腺苷和生物素修饰的适体报告序列与腺苷适体竞争结合，导致连接于磁性微球的链霉亲和素金纳米量的差异，实现腺苷的化学发光间接检测。并利用羟胺放大金纳米的特性极大提高了化学发光检测灵敏度。本方法优点在于灵敏度高，特异性强，测定范围宽，设备简单，操作简便，适合测定腺苷的血、尿试样，为临床诊断疾病提供有利分析数据。

主权项

一种基于适体技术金纳米化学发光放大检测腺苷的方法，其特征在于包含以下步骤：（1）链霉亲和素金纳米制备：取100mL 0.01%HAuCl₄120℃加热至沸腾，迅速加入4mL 2%Na₃C₆H₅O₇再沸10min后自然冷却，再加入10 mL0.022mol/L链霉亲和素，反应10min，加入500µL 1%BSA稳定剂，6000r/min离心1h，弃去上清液，沉淀再用1%BSA洗涤3次，最后用pH7.0的0.1mol/L PBS缓冲液定容至100mL，置4℃下保存备用； （2）传感器检测腺苷：取40 µg羧基修饰的磁性微球，置于1.5mL离心管中，通过磁性分离器分离，弃去上清液，用100µL咪唑缓冲液洗涤磁性微球三次，加入100µL含1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺即EDC的0.1M pH6.0咪唑缓冲液悬浮磁性微球，置37℃ 的恒温振荡器中活化20min（振荡速度170r/min）；然后加入30pmol氨基修饰的腺苷适体，37℃ 的恒温振荡器中，反应lh; 磁性分离器分离，弃去上清液，用100µL WB (即7mM pH8.0 Tris–HCl、 0.17 M NaCl、0.05% Tween 20溶液) 溶液洗涤，进行三次；加入10%BSA溶液，37℃下封闭反应lh,WB溶液洗涤三次；加入10pmol生物素修饰的腺苷适体互补序列的BA（20 mM pH 8.0Tris–HCl、0.5 M NaCl溶液）溶液100µL， 37℃的恒温振荡器中反应lh，平行处理多份；分别加入一系列不同浓度的目标物腺苷及待测样品溶液，每管总体积为100µL，37℃的恒温振荡器中反应lh，磁性分离器分离，WB溶液洗涤三次；再分别加入50µL链霉亲和素金纳米SA‑Au的PBS缓冲液， 37℃下恒温振荡器中反应1h；随后，最后用含有2%BSA的WB洗涤液通过磁性分离器洗涤磁性微球复合物3次；（3）检测方法：将磁性微球复合物用0.1M PBS定容50µL；加入4℃溴饱和水溶液50µL，常温下反应10min，60℃反应20min，从中取该溶液90µL与100µL10^‑5mol/L鲁米诺溶液迅速混合后立即置化学发光仪中测定；以加入腺苷的浓度为横坐标，以发光强度为纵坐标，绘制标准曲线；根据标准曲线计算待测样品中腺苷浓度。