[发明专利]一种猪乙型脑炎病毒纯化方法

摘要

本发明提供了一种猪乙型脑炎病毒（JEV）纯化方法，该方法综合采用了微滤澄清纯化法，超滤浓缩纯化法，重复洗滤法等一系列工艺，最大限度的增大了JEV的回收效率，降低了纯化成本。以本发明制备的猪乙型脑炎病毒浓缩液成品尤其适用于制备疫苗，以本发明制备的猪乙型脑炎病毒浓缩液成品制备的疫苗相对于现有技术的猪乙型脑炎病毒疫苗而言，具有纯净度高，安全性高，均一性好、免疫效果好等优点。同时，本发明工艺简便、成本较低，具有突出的规模化应用前景。

主权项

一种猪乙型脑炎病毒纯化方法，其特征在于使用微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统实现病毒液的纯化，并包括以下步骤：1.1前处理1.1.1系统的组装无菌条件下，将澄清纯化系统和浓缩系统按照组装要求进行组装；在澄清系统中安装无菌0.65μm、完整无损的中空纤维微滤膜，在浓缩系统中安装孔径为300KD的无菌中空纤维超滤膜；1.1.2系统完整性检测压力保持法检测纯化系统的完整性；1.1.3系统的处理清洗及灭菌：将0.5M NaOH溶液注满纯化系统的进料罐，浸泡处理20min，开启循环泵300rpm，进行系统的清洗及灭菌处理30min；水洗及通量检测：灭菌结束后，排尽系统内的NaOH溶液；将无菌超纯水注满系统的进料罐，开启循环泵，300rpm循环30min，弃尽系统内的液体，如此反复水洗，直至系统内PH为7.0；PBS处理：水洗结束后，弃尽最后一次超纯水；将0.1M PBS溶液注满进料罐，开启循环泵300rpm循环冲洗20min；1.2病毒的澄清纯化1.2.1病毒液的处理将5L无菌的吐温20加入100L猪乙型脑炎病毒(JEV)病毒液中，振荡处理10min；1.2.2病毒液的澄清澄清系统处理完毕后，弃尽系统内的PBS溶液，将振荡处理后的病毒液，注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，400rpm循环30min，经0.65μm中空纤维微滤柱进行纯化处理，收集透过液90L，进料罐内存留截留液10L；1.2.3截留液的洗滤第一次洗滤：将10L无菌的0.1M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵400rpm循环30min，收集透过液10L，记为洗滤液1；第二次洗滤：将10L无菌的0.1M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵400rpm循环30min，收集透过液10L，记为洗滤液2；第三次洗滤：将10L无菌的0.1M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵400rpm循环30min，收集透过液10L，记为洗滤液3；1.2.4病毒液的收集将上述澄清纯化过程所收集的透过液及三次洗滤液混合均匀，得到混合液120L；1.2.5初级浓缩浓缩系统处理完毕后，将混合液注入浓缩系统的进料罐，开启循环泵，400rpm循环30min，经300KD中空纤维超滤柱进行纯化处理，弃去透过液，进料罐中剩余截留液10L，记为初级浓缩病毒液；1.2.6浓缩液的洗滤第一次洗滤：将10L 0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩液中，重悬，开启循环泵，400rpm循环30min，弃去透过液10L，进料罐中剩余截留液10L，记为二级浓缩病毒液；第二次洗滤：将10L 0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩液，重悬，开启循环泵，400rpm循环30min，弃去洗滤液10L，进料罐中剩余截留液10L，记为三级浓缩病毒液；第三次洗滤：将10L 0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩液，重悬，开启循环泵，400rpm循环30min，弃去洗滤液10L，进料罐中剩余截留液10L，即为病毒浓缩液成品；2.2.7病毒液的收集将经过上述处理后的得到的病毒浓缩液成品进行收集，保存于‑20℃。