[发明专利]蓖麻蚕蛹做生物反应器制备重组人表皮生长因子的方法

摘要

本发明公开了以蓖麻蚕蛹做生物反应器制备重组人表皮生长因子的方法，属基因工程领域。通过基因工程技术将入门载体pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGF整合到目的载体线性化AnpeNPVDNA核多角体基因启动子下游，获得表达载体重组柞蚕杆状病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPVDNA，所述表达载体经处理后接种蓖麻蚕蛹，高效表达HCEGF，经孵育、分离纯化制备出功效类似天然产物的重组人表皮生长因子。本发明属真核细胞基因表达法，具有蛋白质翻译后修饰过程，表达效率高，表达产物的生物学特性与天然产物相似的优点，且蚕蛹材料来源丰富，对提升蓖麻蚕的经济价值，促进广西的养蚕事业发展具有重要意义。

主权项

蓖麻蚕蛹做生物反应器制备重组人表皮生长因子的方法,其特征在于：通过基因工程技术将入门载体pENTR^TM4Dual‑6xHis‑HCEGF整合到目的载体线性化AnpeNPV DNA核多角体基因启动子下游，获得表达载体重组柞蚕杆状病毒6xHis‑HCEGF‑AnpeNPV DNA，所述表达载体经处理后接种蓖麻蚕蛹，高效表达HCEGF，经孵育、分离纯化制备出功效类似天然产物的的重组人表皮生长因子；其中：（1）所述入门载体的构建方法为：用NcoⅠ/EcoRⅠ双酶切消化HCEGF/pET‑28a质粒，获得拥有从起始密码子ATG到终止密码子TAA结束的完整阅读框架（orf）、且N端附有6xHis的6xHis‑HCEGF基因片段，将该基因片段插入到Nco Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切过的pENTR^TM4Dual质粒的NcoⅠ和EcoR Ⅰ之间，获得入门载体pENTR^TM4Dual‑6xHis‑HCEGF，使6xHis‑HCEGF片段位于质粒中的attL1和attL2之间；（2）所述目的载体的构建方法为：提取柞蚕杆状病毒AnpeNPV DNA，通过DNA同源同组技术在AnpeNPV DNA的核多角体基因启动子下游插入由AvrⅡ酶切位点相连的attR1和aatR2序列构建目的载体AnpeNPV，抽提AnpeNPV DNA并通过AvrⅡ酶切线性化；（3）所述表达载体的构建方法为：取所述入门载体pENTR^TM4Dual‑6xHis‑HCEGF150ng、目的载体线性化AnpeNPVDNA150ng、5×LR克隆酶混合物2μl、pH8.0TB缓冲液混合至10μl，25℃温浴1‑16小时；pENTR^TM4Dual‑6xHis‑HCEGFDNA与线性化AnpeNPV DNA在LR克隆酶作用下进行重组，生成表达载体重组柞蚕杆状病毒6xHis‑HCEGF‑AnpeNPVDNA；（4）所述表达载体接种蓖麻蚕蛹前的处理方法为：用所述表达载体重组柞蚕杆状病毒6xHis‑HCEGF‑AnpeNPV DNA接种柞蚕宿主AnPe细胞，27℃培养1周后收取上清表达载体病毒液并反复扩大培养后进行斑点形成法测定感染力PFU和‑80℃保存备用。