[发明专利]蚊媒病毒常温收集、保存和检测方法

摘要

蚊媒病毒常温收集、保存和检测方法，属于病毒的收集、保存及检测。本发明利用蚊虫吮吸糖液过程中唾液反吐同时排出病毒的生物学特性，把捕捉的蚊虫放入青霉素瓶中，并设计与蚊虫数量适应的纱笼和一定浓度的糖液饱和滴加RNA保存液的滤纸，在常温下以滤纸为病毒RNA载体收集病毒，于常温保存载体7天内进行实验室检测，分析准确，改变了冷链技术野外运输、携带和保存的麻烦，提高了病毒收集、保存效率，节省了人力物力。

主权项

蚊媒病毒常温收集和保存、及检测方法，包括以下步骤：（1）在疑似蚊媒致病病毒区域，捕捉30~200只同一种类或不同种类的蚊虫逐一地放入青霉素小瓶中，过夜，饥饿后，待进入步骤 （2）；（2）按以下两种方法之一收集病毒： (a) 室温24~27℃下，把定性滤纸剪成3cm²若干份作为收集病毒的载体，每份滤纸中央标记滴加 RNA保存液的位置，取若干个干净培养皿加10% 蔗糖水，把医用棉球浸泡在培养皿中，将滤纸放在棉球上，再在滤纸标记位置滴加0.25ml RNA保存液，按每份滤纸20~70只蚊虫将步骤1）存活的蚊虫驱入放有培养皿的15~30cm³纱笼内，让蚊虫取食，每天换一次滤纸，共5~7天；    或者，(b) 把步骤1）收集于青霉素小管中的蚊虫‑85℃ 冻存，按 48小时间隔分批用空斑试验检测蚊虫的感染病毒滴度，收集病毒液；之后，把定性滤纸剪成3cm²若干份作为收集病毒的载体，每份滤纸中央标记滴加 RNA保存液和病毒液的位置，取若干个干净培养皿，放置医用棉球，将滤纸放在棉球上，在滤纸标记位置滴加0.25ml RNA保存液，再取病毒液于同一位置滴加0.25ml；（3）病毒保存将步骤2）(a)蚊虫取食过的滤纸或步骤2）(b)滴加了蚊虫病毒液的滤纸作为病毒载体在室温24~27℃下分别放置，并在7天内进行检测；（4）对被蚊虫取食过的载体提取病毒RNA用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒规定方式提取病毒RNA；（5）PCR扩增及检测 设计PCR反应体系的病毒菌的5’，3’端保守序列引物及该引物的PCR反应条件；以PCR反应产物凝胶成像及测序鉴定。