[发明专利]一种含有双报告基因的双T-DNA载体及其构建方法和应用

摘要

本发明提供了一种含有双报告基因的双T-DNA载体及其构建方法与应用。本发明对传统的双T-DNA载体进行改进，将利用生物安全标记基因和剔除转基因植株选择标记基因这两种方法相结合，将报告基因GUS基因和选择标记基因连入同一个T-DNA区域，将GFP基因和目的基因连入另一个T-DNA区域，得到含有双报告基因的双T-DNA载体，通过后代自交分离检测两个报告基因，剔除目的基因与选择标记基因发生共整合的转基因植株，最终得到只有目的基因而无选择标记的转基因安全植株，快速筛选得到含有目的基因和生物安全标记GFP的转基因安全植株，这样大大节省了人力物力财力，有效提高了基因整合的效率以及安全转基因植株的产生。

主权项

一种构建双T‑DNA载体的方法，其特征在于，所述双T‑DNA载体为pTRIDT313，包括以下步骤：(1)以pCMBIA1302载体为模板，以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为引物，分别进行PCR扩增得到T‑DNA左右边界LB和RB，LB引入酶切位点SphI和BglII，RB引入酶切位点SacI和SphI；(2)将左右边界LB和RB分别连到pMD19‑T载体，与骨架载体pCAMBIA1302分别进行酶切，再用T4连接酶进行三片段连接，得到含两套T‑DNA边界的双T‑DNA载体pTRIDT313。