[发明专利]一种只有35bpfrt位点序列的重组载体及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种只有35bpfrt位点序列的重组载体及其构建方法与应用，即一种含有截短的单个Frt特异性重组位点的表达载体的构建方法和应用，其特征序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其构建方法步骤为：A.质粒pBI-GFP的构建；B.DNA片段Frt-GFP-Tnos的获得；C.质粒pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos的构建。本发明方法简单易行，操作方便，该载体在多基因转化方面具有应用价值和前景。

主权项

一种只有35bpfrt位点序列的重组载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：质粒pBI‑GFP的构建：利用BamHI和SacI内切酶切除pBI121载体中的GUS基因，同时在GFP两端加上BamHI和SacI酶切位点，再将GFP插入pBI121载体构建成pBI‑GFP载体；DNA片段Frt‑GFP‑Tnos的获得：以Frtm‑HindIII‑GFP(5'‑TGC AAGCTT AGTTCCTATAC TTTCTAGA GAATAGGAACTTC GGA ATGAGTAAAG GAGAAGAACT TTTCA‑3’)和Tnos‑HindIII‑3’(5'‑TGC AAGCTT CGATCTAGTAACATAGATGACACCG‑3’)为一对引物，利用LA‑Taq酶扩增pBI‑GFP，由于引物Frtm‑HindIII‑GFP含有Frt位点，通过PCR将Frt位点加在GFP‑Tnos之前，获得Frt‑GFP‑Tnos片段。Frtm代表了一种缩减的Frt位点，此位点只包含了核心序列，具有完整Frt位点的作用；质粒pBI‑Frt‑GFP‑Tnos‑35S‑GUS‑Tnos的构建：将DNA片段Frt‑GFP‑Tnos插入pBI121载体的HindIII位点，构建含有Frt特异性重组位点的表达载体T18，T18的结构为pBI‑Frt‑GFP‑Tnos‑35S‑GUS‑Tnos。