[发明专利]利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法

摘要

本发明公开了一种利用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法。其步骤如下：待棉花幼苗长至10 d左右，两片子叶完全展开后，选取长势一致的幼苗，分别用300、500和700 mg·L‑1的乙烯利涂抹子叶，同时对照用蒸馏水涂抹，经过乙烯利处理5 d后，提取子叶的基因组DNA；再通过MSAP分析，对回收的差异条带纯化和测序继而进行功能分析。本发明利用MSAP技术，分析棉花子叶经乙烯利处理后CCGG位点胞嘧啶甲基化水平和模式的变化，进而分离乙烯利诱导的甲基化差异片段，以期从基因组水平上揭示乙烯利调控棉花衰老的调控机制提供理论依据。

主权项

一种利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法，其特征在于，按如下步骤进行：A.材料的处理首先棉花种子经浓硫酸脱绒后，用无菌水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分，粒选饱满、正常发育的种子备用，然后通过沙培的方式培养，将种子植于育苗盘中，28℃培养箱暗培养2d后转至光照培养箱中继续培养，培养条件是12h/d的光照时间，45μmol·m‑2·s‑1的光照强度，温度30±1℃，待棉花幼苗长至10d，两片子叶完全展开后，分别用300mg·L‑1、500mg·L‑1和700mg·L‑1的乙烯利涂抹长势一致的幼苗子叶，每天上午10点和下午4点，分别涂抹两次，每个处理选取10株为一组，重复三次，同时对照用蒸馏水处理；经过乙烯利处理5d后，将棉花幼苗的子叶用经过消毒的刀片切下，并保存于－80℃冰箱中备用；B.提取步骤A中子叶的基因组DNA；C.对所提取的棉花子叶基因组DNA进行双酶切；所述双酶切体系为：DNA模板300‑500ng，Thermo 5‑10U EcoRI；2μL 10×Buffer EcoRI，其中含500mM Tris‑Hcl，pH＝7.5；100mM MgCl2；1000mM NaCl；0.2％Trition X‑100；1mg/ml BSA，加ddH2O至20μL，反应混合液在37℃保温6‑12h，然后65℃水浴20min；再将上一步的酶切产物进行第二步酶切，酶切反应体系30μL为，第一步酶切产物20μL，5‑10U HpaII或MspI；3μL 10×Buffer Tango，其中含330mM Tris‑Ac，pH＝7.9，100mM Mg‑Ac，660mM K‑Ac，1mg/ml BSA；加ddH2O至30μL，反应混合液在37℃保温6‑12h，然后水浴20min后备用，其中水浴温度按HpaII 65℃或MsIp 80℃；D.对酶切后的DNA模板进行连接；连接体系为：将双酶切产物，加入3‑5U Thermo T4DNA连接酶，5pmol EcoRI接头，50pmol HpaII或MspI接头，4μL 10×T4DNA Ligase Buffer，加ddH2O至40μL，21‑23℃连接8‑12h，产物稀释10倍后备用；E.MSAP预扩增反应；MSAP预扩增反应体系为：0.5‑2μL的连接产物稀释液，1.5‑3μL的2.5mM dNTPs，2‑3.5μL的10×PCR Buffer，0.5‑2U的Taq DNA聚合酶，预扩增引物 E0和H0各2.5‑10μmol，加ddH2O至25μL，PCR条件为95℃5min；95℃30s，56℃1min，72℃1min，20轮循环；72℃10min，4℃终止，然后把预扩增产物稀释10‑100倍以备用；F.MSAP选择性扩增反应；MSAP选择性扩增反应体系：0.5‑2μL的连接产物稀释液，1.5‑3μL的2.5mM dNTPs，2‑3.5μL的10×PCR Buffer，0.5‑2U的Taq DNA聚合酶，选择性扩增引物E1－E11和H1－H6各2.5‑10μmol，加ddH2O至25μL，PCR条件为95℃5min；95℃30s，65℃30s，每轮循环减少0.7℃；72℃1min，12轮循环；95℃30s，56℃30s，72℃1min，23轮循环；72℃10min，4℃终止；以上所用引物组合如下表所示：G.反应产物的电泳检测，特异性条带的回收；H.回收条带的纯化、测序；I.差异序列的功能分析。