[发明专利]定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法

摘要

本发明涉及一种定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法，包含以下步骤：在颖壳颜色决定基因OsCHI外显子区选取靶标片段并构建植物CRISPR/Cas9打靶重组载体，将该重组载体导入水稻细胞并再生成苗，在载体中的表达框的作用下对水稻细胞进行剪切，触发水稻细胞DNA的自我修复功能。再通过对再生株系基因组目标片段的测序，获取携带两个等位OsCHI基因同时发生功能缺失突变的株系，经过颖壳颜色鉴定，即为所创制的褐壳水稻材料。实验表明，本方法可利用颖壳颜色决定基因OsCHI快速创制褐壳水稻材料。

主权项

一种定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)，在水稻颖壳颜色决定基因OsCHI外显子区选取靶标片段，所述靶标片段的一条链具有5’‑(N)_X‑NGG‑3’结构，其中(N)_X表示数目为X的一条碱基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中为碱基A、G、C、T中的任意一个；2)，按照所述靶标片段的核酸排列顺序，构建用于水稻OsCHI基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，所述重组载体包括具有所述靶标片段的向导RNA表达框，以及Cas9核酸酶表达框；3)，将所述重组载体导入水稻细胞，诱导所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达，剪切OsCHI基因的双链的所述靶标片段，触发水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内OsCHI基因的功能缺失突变；4)，用导入所述重组载体的水稻细胞再生若干水稻植株；5)，通过基因组PCR方法克隆再生植株中OsCHI基因包含靶标片段的DNA区段，并对扩增产物测序。6)，选择两个等位OsCHI基因都出现功能缺失突变的再生株系，进行表型鉴定，以筛选出种子变为褐色的再生株系。