[发明专利]限制性内切酶和核酸外切酶Ⅲ的无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法有效
| 申请号： | 201410220070.8 | 申请日： | 2014-05-22 |
| 公开（公告）号： | CN103993083A | 公开（公告）日： | 2014-08-20 |
| 发明（设计）人： | 卫伟;高春燕;刘松琴 | 申请（专利权）人： | 东南大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12Q1/48;C12Q1/34 |
| 代理公司： | 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204 | 代理人： | 沈振涛 |
| 地址： | 211189 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开一种基于限制性内切酶HpaⅡ和核酸外切酶Ⅲ的DNA甲基化及甲基化转移酶活性的检测方法。制备了无标记的DNA探针，该探针序列包含了限制性内切酶的切割位点和甲基化的CpG位点,通过该无标记的DNA探针与目标DNA杂交，用甲基化转移酶进行甲基化处理，再用限制性内切酶HpaⅡ的特异性切割以及作用于双链DNA的3'→5'外切酶活性的核酸外切酶Ⅲ作用，然后利用荧光信号分子噻唑橙对单双链DNA不同信号实现检测甲基化及甲基转移酶活性的目的。本发明无需制备复杂材料和标记DNA探针，可避免材料制备及标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。本发明具有成本低、快速、简便、灵敏度高的优点。 | ||
| 搜索关键词： | 限制性 内切酶 核酸外切酶 标记 荧光 检测 dna 甲基化 甲基转移酶 活性 方法 | ||
【主权项】：
一种基于限制性内切酶和核酸外切酶Ⅲ无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)无标记的探针DNA和目标DNA的选取：所述无标记的探针DNA和目标DNA部分互补，并且都包含一段能被限制性内切酶识别并切割的5'‑CCGG‑3'特定序列，并且3'尾部分别都多出6个碱基序列；(2)无标记的探针DNA与目标DNA的杂交；(3)甲基化转移酶对双链DNA上CpG位点进行甲基化；(4)对甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ和核酸外切酶ⅢExoⅢ同时作用DNA；(5)加入荧光信号分子；(6)利用荧光分光度计对产物溶液进行检测。
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