[发明专利]一种重组人血管内皮抑素的提取纯化方法

摘要

本发明的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，包括以下步骤工程菌发酵、工程菌破碎、包涵体洗涤、重组人血管内皮抑素的变性纯化、变性重组人血管内皮抑素的复性、复性重组人血管内皮抑素的放置、重组人血管内皮抑素的层析分离。本发明的方法，工程菌发酵过程中可实现在较高菌体浓度下达到高效诱导表达，并在变性重组人血管内皮抑素复性过程中达到较高的复性率，由此实现了重组人血管内皮抑素大规模生产。

主权项

一种重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)工程菌发酵：将工程菌发酵至发酵液OD600值为10‑15，加入诱导剂IPTG、碳源物质以及氮源物质，使发酵液中IPTG的浓度为0.2‑0.4mmol/L，在30‑37℃下，对工程菌培养2.5‑3.5h，再向其中加入诱导剂IPTG，使发酵液中IPTG的浓度为0.1‑0.3mmol/L，继续培养3‑5h；所述碳源物质为葡萄糖；所述氮源物质为酵母提取物、胰蛋白胨和水解酪蛋白中的一种或多种；(2)工程菌破碎：对步骤1)中得到的发酵液进行洗涤、离心，留沉淀物，向发酵液中加入溶菌酶，在2‑8℃下，搅拌均匀，破碎至细菌破碎率大于98％，得到破碎后的菌液；(3)包涵体洗涤：将破碎后的菌液离心，留沉淀物，将沉淀物用含有缓冲剂的洗涤缓冲液进行搅拌洗涤；(4)重组人血管内皮抑素的变性纯化：采用变性缓冲液将洗涤后的包涵体溶解，离心，取上清液，调整至蛋白浓度为8‑10mg/ml，得到变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液；(5)变性重组人血管内皮抑素的复性：将蛋白浓度为8‑10mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液加入复性液中，混合均匀，2‑8℃下静置至少10h，除去所述复性液，得到复性重组人血管内皮抑素；每1L的所述复性液包括以下组分：盐酸胍1‑2mol；还原型谷胱甘肽2‑3mmol；氧化型谷胱甘肽0.2‑0.3mmol；络合剂2‑8mmol；所述复性液的pH值为4.0‑5.0(6)复性重组人血管内皮抑素的放置：将步骤5)中得到的复性重组人血管内皮抑素在温度23‑27℃下放置5‑8天；(7)重组人血管内皮抑素的层析分离：将步骤6)中的复性重组人血管内皮抑素层析洗脱，收集重组人血管内皮抑素蛋白，即得。